Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 125
Bakterium und mobiler Beschichtung unterbunden und damit das Problem der Kon-
zentrationsabhängigkeit behoben werden. Die Voruntersuchungen zur Entwicklung
der UV-CE-Methode in Abschnitt 4.2.6.2 zeigten jedoch, dass vor allem der Teststamm
P. fluorescens sehr empfindlich auf hohe Ionenstärken reagiert, wodurch eine Kontrolle
der Bakterienadsorption an der Beschichtung auf elektrostatischem Wege in unserem
Fall nicht möglich war und in der Injektionstechnik nach einer Lösung des Problems
gesucht wurde.
4.3.5.1 Injektionstechnik
Offensichtlich kommt es bei der Injektion einer relativ großen Zelldichte zu Wech-
selwirkungen der Bakterienzellen untereinander, wodurch “sample stacking” erreicht
wird und die Verzögerung der elektrophoretischen Wanderung durch Wandadsorpti-
on verhindert wird (Abschnitt 4.2.6.4). Die Fokussierung der Signale stark verdünnter
Fluoreszenz-markierter Bakteriensuspensionen (10 5 -10 7 Zellen/ml) gelang schließlich
durch eine zweite Injektion einer unmarkierten Zellsuspension mit einer Konzentra-
tion von 0.5 OD600 (≈1.5 x 10 8 Zellen/ml). In Abbildung 4.46 ist der fokussierende
Effekt der Nachinjektion am Beispiel der Pseudomonas-Spezies dargestellt. Die Elek-
tropherogramme Fluoreszenz-markierter gesunder Bakteriensuspensionen mit einer
Konzentration von 1.5 x 10 6 Zellen/ml wurden unter dem Einfluss verschiedener un-
markierter Bakterienkonzentrationen der zweiten Injektion bei 520 nm aufgezeichnet.
Zur Fluoreszenzmarkierung wurden die im nächsten Abschnitt (Abschnitt 4.3.5.2) be-
schriebenen und validierten Markerkonzentrationen eingesetzt. Ähnlich wie in Abbil-
dung 4.38a zeigten sich charakteristische Peakmuster in Abhängigkeit der Zelldichte in
der zweiten Injektion. Während Elektropherogramme Fluoreszenz-markierter Bakteri-
ensuspensionen ohne nachfolgende Injektion keine Signale innerhalb 30 Minuten auf-
wiesen (Abbildung 4.46(A)), wurden die Peaks mit zunehmender Zellkonzentration
in der nachinjizierten Bakteriensuspension mehr und mehr fokussiert. Mit einer nach-
injizierten 0.1-OD600-Zellsuspension wurde ein breites Signal nach einer Migrations-
zeit von 30 Minuten (Abbildung 4.46(B)) erhalten, das mit einer 0.5-OD600-Suspension
zu einem scharfen Peakmuster mit einer Trennleistung von ca. 200.000 theoretischer
Böden/m führte und die Zusammensetzung der Bakterienpopulation, bestehend aus
Einzelzellen und Zellketten, beschrieb (Abbildung 4.46(C)).