Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

stimmung der antimikrobiellen Aktivität potenzieller Wirksubstanzen entwickelt. Da-
zu wurde auf dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (CE) (Abschnitt 4.2) und der
magnetischen Kernresonanz (NMR) (Abschnitt 4.4) nach Methoden zur Beschreibung
von Bakterienkulturen gesucht und diese Zytotoxizitätsbestimmungen zugänglich ge-
macht.
Nach Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen und Optimierung der Bakterienkul-
turen und deren Probenpräparation konnte für Pseudomonas fluorescens und Strepto-
coccus vestibularis eine kapillarelektrophoretische UV-Methode mit guter Präzision, Se-
lektivität, Spezifizität und Linearität etabliert werden. Sie erlaubte die Trennung ver-
schieden großer Agglomerate und Ketten und die Erstellung charakteristischer Fin-
gerabdrücke. Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid, den beiden Fluo-
reszenzmarkern im “LIVE/DEAD BacLight viability kit”, ermöglichte mittels LIF-CE
die Konstitution der Bakterienkulturen zu untersuchen. Die beiden Nucleinsäure-
bindenden Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden sich in ihrer Eigenschaft in gesun-
de Zellen einzudringen, wodurch eine Differenzierung zwischen lebenden und to-
ten Zellen möglich wird: SYTO9 färbt alle Zellen grün, Propidiumiodid färbt alle
Zellen mit beschädigter Membran rot. Die Aufzeichnung mikrobieller Elektrophero-
gramme im Zwei-Kanal-Modus mittels LIF-Detektion ermöglichte das Verhältnis le-
bender zu toter Zellen mit charakteristischen elektrophoretischen Profilen zu korre-
lieren. Mit dieser neuen LIF-CE Methode, die erst durch Nachinjektion unmarkier-
ter Bakterienzellen als “stacking front” möglich wurde, konnte die Tendenz der mi-
krobiellen Kettenbildung und die Änderung des lebend/tot-Verhältnisses der Bakte-
rienkultur in Gegenwart unterschiedlicher Antibiotikakonzentrationen direkt beob-
achtet werden. Mit Hilfe der Korrelation des grün/rot-Fluoreszenzverhältnisses mit
dem prozentualen Anteil lebender Zellen wurden für Arzneistoff-exponierte Bak-
terienkulturen Dosis-Wirkungs-Diagramme erstellt und die entsprechenden ED50-
Werte berechnet. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden die ED50-Messung auch am
Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR) durchgeführt und ebenso die entspre-
chenden MHK-Werte mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren nach DIN be-
stimmt. Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und Vancomycin-HCl zeigten für die fluorime-
trischen Methoden als auch für das Mikrodilutionsverfahren vergleichbare Ergebnisse.
Die fluorimetrischen Verfahren ermöglichten eine schnelle Differenzierung zwischen
zytostatischer und zytotoxischer Wirksamkeit, was mittels Mikrodilutionsverfahren
nicht möglich ist.
Mittels NMR konnte bei 17.6 Tesla im Bildgebungsexperiment gezeigt werden, dass
sich die transversale Relaxation T2 gut zur Beschreibung der Bakterienproliferation
verschiedener Anaerobier eignet. Der Parameter T2, welcher durch den chemischen
Austausch beeinflusst wird, erfasst dabei das Mittel aller wachstumsbedingten Ände-
rung in der Zellkultur. Durch Nährstoffverzehr, Metabolitenproduktion und steigen-
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