Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

92 4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode
Trotz aller Bemühungen zeigten die Elektropherogramme der Mikroben unter Verwen-
dung der Methode nach Armstrong teilweise eine schlechte Auflösung und fehlende
Reproduzierbarkeit, die aber für den Einsatz der CE zur Zytotoxizitätsbestimmung
unerläßlich ist. Aus diesem Grund wurden nachfolgend
• die Pufferkonzentration
• die polymere Matrix
• und die Probenpräparation
variiert und für den Teststamm M. luteus optimiert.
4.2.6.3.1 Pufferkonzentration
Eine mögliche Ursache für die schlechte Auflösung und die fehlende Reproduzier-
barkeit war die extrem geringe Ionenstärke im Trennpuffer. Die daraus resultierende,
sehr geringe Stromstärke lag bei einer Spannung von 10 KV unter 1 µA, wodurch sich
natürliche Schwankungen in der Temperatur, Spannung oder Wasserreinheit leicht be-
merkbar machten. Gegen eine Erhöhung der Pufferkonzentration spricht jedoch die
dadurch sinkende Mobilität des EOFs (Abschnitt 3.4).
In wässriger Lösung sind Mikroben meist negativ geladen. Bei anodischer Injektion
und konventioneller Polung (Abschnitt 3.4) würden die Biokolloide alleine aufgrund
ihrer elektrophoretischen Mobilität überhaupt nicht durch die Kapillare wandern. Ist
der EOF jedoch groß genug, zieht er die Probenzonen am Detektor vorbei. Der EOF
liefert bei Mikroben den wesentlichen Beitrag zur Analysenzeit, denn aufgrund der
großen Masse m der Mikroorganismen ist ihre Beschleunigung a aufgrund des elektri-
schen Feldes E (Fel = q · E = m · a) sehr klein und damit auch ihre Gleichgewichtsge-
schwindigkeit vel.
Zur Festlegung eines sinnvollen Konzentrationsbereiches des Trennpuffers wurde zu-
nächst der Einfluss verschiedener Pufferkonzentrationen auf den EOF analysiert. Dazu
wurde eine Stammlösung mit 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2EDTA (siehe Expe-
rimenteller Teil) zu verschiedenen Konzentrationen verdünnt und jeder Verdünnung
0.0125 % PEO 600.000 als Modifikator zugesetzt. In Abbildung 4.18 ist der EOF, mar-
kiert durch Benzylalkohol, in Abhängigkeit von der Pufferkonzentration und Ionen-
stärke dargestellt. Die verwendeten Pufferlösungen (A-I) sind in Tabelle 4.5 gelistet.
Die Elektrolyte wurden im Konzentrationsbereich von 0.11 mM Tris-Borat und 0.003
mM Na2EDTA bis 3.90 mM Tris-Borat und 0.088 mM Na2EDTA eingesetzt. Während
sich der EOF bei einer Ionenstärke zwischen 0.069 mM und 0.49 mM kaum änderte und
bei ca. 3 Minuten lag, fiel er ab einer Ionenstärke >0.69 mM stark ab und benötigte bei
einer Ionenstärke von 2.43 mM bereits nahezu 10 Minuten. Der interessante Konzentra-