Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 117
4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid
Die fluoreszenzspektroskopische Analyse einer Zellpopulation auf der Basis der SY-
TO9- und Propidiumiodid-Markierung (Abbildung 4.40) hat den Vorteil, dass sowohl
lebende als auch tote Bakterienzellen bei verschiedenen Wellenlängen simultan er-
fasst werden und aus der relativen Fluoreszenzintensität die Konstitution einer Bak-
terienpopulation quantitativ beschrieben werden kann. Dies hat zur Folge, dass sich
bei Kopplung der fluorimetrischen Detektion mit analytischen Trenntechniken wie
z. B. der Kapillarelektrophorese die Verwendung eines internen Standards erübrigt.
Die Lebend-Tot-Markierung mit den beiden Nucleinsäure-bindenden Farbstoffen be-
ruht auf ihren unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und ihrer unterschiedlichen
Fähigkeit in Bakterienzellen einzudringen [4]. Während SYTO9 membranpermeabel
ist und alle Zellen einer Bakterienpopulation grün färbt, wird Propidiumiodid mit sei-
ner charakteristischen roten Fluoreszenz von gesunden Zellen durch seine Membran-
impermeabilität ausgeschlossen. Einige Bakterienstämme verfügen desweiteren über
Efflux-Pumpen, womit Propidiumiodid aktiv aus lebenden Zellen transportiert wer-
den kann [254]. In toten Zellen führt sowohl die Verdrängung von SYTO9 durch Pro-
pidiumiodid aufgrund stärkerer DNA-Bindung als auch die Fluoreszenzauslöschung
der SYTO9 Emission durch “fluorescence resonance energy transfer”(FRET, Abschnitt
3.3.3) zum Ersetzen der grünen gegen die rote Fluoreszenz [254]. Der letztere Mecha-
nismus ist aufgrund der spektralen Überlappung der beiden Marker möglich.
Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid verläuft sehr schnell und erfor-
dert lediglich eine Inkubationszeit von 15 Minuten [12,14]. Dann zeigen lebende Zellen
eine grüne und tote Zellen eine rote Fluoreszenz.
Die Routineanwendung der SYTO9-Propidiumiodid-Markierung ist jedoch nicht un-
problematisch. Zwar ist unbestritten, dass Bakterienzellen, die sich mittels Propidi-
umiodid anfärben lassen weder lebensfähig noch kultivierbar sind, doch wurde bei
gleichzeitiger Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid auch von Fällen be-
richtet, bei denen sowohl für lebende als auch für tote Zellen die gleiche rote oder
grüne Fluoreszenzintensität detektiert wurde [254]. Solche konfusen, zweideutigen Si-
tuationen können durch die extrem großen Unterschiede in der Emissionsintensität
von SYTO9 und Propidiumiodid verursacht werden. Während SYTO9 an DNA gebun-
den eine starke Fluoreszenz aufweist [228], zeigen Propidiumiodid-markierte Proben
nur eine sehr geringe Fluoreszenzintensität bedingt durch den sehr kleinen Extinkti-
onskoeffizienten des Propidiumiodids [28]. Zum anderen muss aber auch berücksich-
tigt werden, dass das Emissionsspektrum von SYTO9 mit dem Anregungsspektrum
von Propidiumiodid überlagert. Diese Tatsache ist die Grundlage dafür, dass eine ge-
genseitige Fluoreszenzauslöschung und damit die simultane Lebend-Tot-Bestimmung
überhaupt möglich ist - führt aber bei einem Missverhältnis der Markerkonzentratio-
nen unter Umständen zu uneindeutigen Fluoreszenzerscheinungen. In jedem Fall er-