Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

5.3 Berechnung von ED50-Werten 175
pension der Konzentration 10 5 Zellen/ml hinzugefügt (Tabelle 5.1). Der Testbe-
reich lag damit zwischen 100 µM und 10 pM mit einem Lösungsmittelanteil von
1 %. Positiv(Trypanosomen in Baltz Medium mit 1 % Lösungsmittel)- und Nega-
tiv(Testsubstanz in Medium ohne Trypanosomen zur Erfassung der Eigenabsorpti-
on)kontrollen wurden bei jedem Test zusätzlich inokuliert. Die Platten wurden an-
schließend bei 37 ◦ C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 24 h inkubiert. Nach Zuga-
be von 20 µl steril filtriertem AlamarBlue in jede Vertiefung erfolgte erneute Inkuba-
tion. Nach einer Gesamtinkubationszeit von 48 h wurden die Platten durch Messung
der Lichtabsorption an einem MR 700 Mikrotiterplatten-Lesegerät (Dynatech, Rückers-
dorf, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 550 nm und einer Referenzwellenlänge
von 630 nm ausgelesen. Die Testung einer Substanz erfolgte als Doppelbestimmung
(siehe Pipettierschema) und wurde zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Ak-
tivität der getesteten Substanzen erfolgte durch Berechnung von ED50-Werten (siehe
Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolation.
5.3 Berechnung von ED50-Werten
Die Auswertung des AlamarBlue-Testes auf Trypanosomen sowie der antibakteriel-
len Testung auf der Basis der SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung erfolgte über
die Bestimmung der ED50-Werte mittels linearer Interpolation. Der ED50-Wert definiert
diejenige Konzentration, bei der 50 % der maximalen Inhibition bzw. Toxizität ein-
tritt. Zu seiner Bestimmung war es zunächst notwendig bei jeder getesteten Konzen-
tration einer bestimmten Substanz die beobachtete Zelldichte bzw. den prozentualen
Anteil lebender Zellen in Bezug auf die eingesetzten Positivkontrollen und Standard-
Lebendigkeits-Kurven zu berechnen. Nach folgender Gleichung konnte daraus der
entsprechende ED50-Wert ermittelt werden.
mit
log(ED50) = log(x1) + y1 − 0.5
(log(x2) − log(x1)) (5.1)
y1 − y2
y1: Bezüglich der getesteten absteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz,
der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der oberhalb 0.5 liegt.
x1: Die zum Wert y1 gehörige Konzentration der Substanz.
y2: Bezüglich der getesteten aufsteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz,
der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der unterhalb 0.5 liegt.
x2: Die zum Wert y2 gehörige Konzentration der Substanz.