Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 123
vestibularis. Die beiden Ausgleichsgeraden enthalten sowohl
• die Vitalitätsbestimmung,
• die Korrektur der spektralen Überlappung von SYTO9 und Propidiumiodid
• als auch die Hintergrundfluoreszenz,
wobei die letzten beiden Faktoren zu den beobachteten positiven Y-Achsenabschnitten
führen. Die ” Vitalitätsgeraden” bilden die Basis für alle weiteren Vitalitätsbestimmun-
gen Arzneistoff-exponierter Bakterienproben und ihre präzise Bestimmung ist unent-
behrlich.
4.3.4.2 Testung
Antibiotika greifen direkt in den katabolen und anabolen Stoffwechsel der Bakterien-
zellen ein; das bedeutet, dass sich die zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit
verwendeten Bakterienkulturen in der exponentiellen Phase befinden müssen [182].
Die Bakterienkulturen zeichnen sich in dieser Phase durch starke Stoffwechselaktivität
und Zellvermehrung aus, so dass die Auswirkung der Antibiotika auf Zellwachstum
und -zustand leicht sichtbar wird. Die Antibiotika wurden in einem Konzentrations-
bereich zwischen 0.01 µM und 100 µM auf ihre toxische Wirkung getestet. Nach ei-
ner Inkubationszeit von 18 h bei 30 ◦ C wurden die Arzneistoff-exponierten Bakterien-
zellen geerntet, gewaschen, mit den optimierten Markerkonzentrationen Fluoreszenz-
markiert und zusammen mit einer Positiv(100 % lebende Zellen)- und einer Nega-
tiv(100 % tote Zellen)kontrolle am FMR mit einer Extinktion bei 488 nm und dualer
Emission bei 520 nm und 655 nm gemessen. Anhand des ermittelten grün/roten Fluo-
reszenzverältnisses wurde aus der Kalibrierfunktion der prozentuale Anteil lebender
Zellen der jeweiligen Bakterienproben errechnet und in Abhängigkeit der eingesetz-
ten Antibiotikakonzentrationen aufgetragen. Abbildung 4.45 zeigt die beiden Dosis-
Wirkungs-Kurven von Ciprofloxacin für P. fluorescens und Vancomycin für S. vestibula-
ris.
Insgesamt wurde die Bestimmung der Zytotoxizität dreimal durchgeführt. Die ent-
sprechenden ED50-Werte berechneten sich mittels linearer Interpolation [134] (Ab-
schnitt 5.3) für Ciprofloxacin zu 5.1±1.6 µM und für Vancomycin zu 2.4±0.7 µM. Dies
entspricht einer Standardabweichung von 31.4 % bei Ciprofloxacin und 29.2 % bei Van-
comycin, womit die Streuung im Rahmen der üblichen Abweichungen von 30 % bei
biologischen Testverfahren liegt [175]. Zur Überprüfung und Interpretation der Ergeb-
nisse wurde die Testung mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren wiederholt
und die entsprechenden MIC-Werte bestimmt (Abschnitt 5.1.8.3). Für Ciprofloxacin
ergab sich ein MIC-Wert von 3.0 µM und für Vancomycin ein Wert von 0.7 µM. Ähn-
liche Aktivitätskonzentrationen sind auch in der Literatur beschrieben, weshalb auf