Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 111
4.2.11 Validierung der Methode
Abbildung 4.37: Kapillarelektrophoretische
Trennung der drei
Bakterienspezies: M. luteus, P.
fluorescens und S. vestibularis. Die
Proben wurden nach einer Gesamtinkubationszeit
von 24 h
präpariert und vor der Injektion
1 Minute im Ultraschallbad
behandelt. Die Probenkonzentration
im Gemisch betrug
0.5 OD600. Für Trennpuffer und
CE-Bedingungen, siehe Abbildung
4.21.
Rein visuell zeigte sich die beste Reproduzierbarkeit der CE-Analyse intakter Mikroor-
ganismen bei den beiden Bakterienstämmen P. fluorescens und S. vestibularis. Aus die-
sem Grund sollte mit diesen die CE-Methode zum Zytotoxizitätstest weiterentwickelt
werden. Um die Frage nach der Eignung der Methode zur weiteren Entwicklung zu
beantworten, musste die Methode validiert werden - denn Validierung ist der Nach-
weis der Eignung für einen bestimmten Gebrauch ” fitness for use” [152]. Zur Validie-
rung der fundamentalen Parameter wie Richtigkeit, Präzision, Linearität, Selektivität,
Spezifizität, Sensitivität und Robustheit wurde den Richtlinien der “International Con-
ference of Harmonization, ICH” und “Food and Drug Administration, FDA” [58–60]
gefolgt. Einige dieser Parameter wurden bereits während der Methodenentwicklung
berücksichtigt: So wurde die Methode darauf ausgerichtet, eine gute Wiederholpräzi-
sion, einen Anwendungsbereich auf mindestens drei Bakterienspezies, und ein rela-
tiv hohes Maß an Robustheit zu besitzen. Auf diesem Wege wurden Grenzen in der
Stabilität des Trennpuffers und der mikrobiellen Analyte festgestellt und optimiert.
Mit der optimierten CE-Methode war zwar die Sensitivität aufgrund der Konzentra-
tionsabhängigkeit der Elektropherogramme beschränkt, die Selektivität und Spezifi-
zität dagegen, wie die Trennung verschiedener Bakterienspezies und deren Agglome-
rate zeigte, gegeben. Um neben diesen bisher qualitativen Betrachtungen, die Metho-
de quantitativ zu charakterisieren, wurden die Wiederholpräzision und Linearität am
Beispiel P. fluorescens genauer untersucht. Auf Richtigkeit der Methode konnte erst im
eigentlichen Zytotoxizitätstest durch Vergleich des errechneten antimikrobiellen Po-
tenzials verschiedener Referenzsubstanzen mit dem aus konventionellen Methoden
geprüft werden.