Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS
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64 4. Ergebnisse <strong>und</strong> Diskussion<br />
der Literatur beschriebenen <strong>Methoden</strong> <strong>zur</strong> Auswertung <strong>von</strong> Trypanosomenkulturen<br />
<strong>zur</strong>ückgegriffen. Die Bestimmung der Trypanosomenproliferation <strong>und</strong> -vitalität kann<br />
radiometrisch durch Messung der Einbaurate radioaktiv markierter Nucleotide wie<br />
z. B. [ 3 H]Hypoxanthin [47, 78] oder durch Auszählen der kultivierten Trypanosomen<br />
mittels Coulter-Counter bzw. mikroskopisch [141] erfolgen (siehe auch Abschnitt 1.2.2<br />
<strong>und</strong> Abschnitt 1.2.3). Der Nachteil all dieser <strong>Methoden</strong> ist jedoch ihr hoher Zeitauf-<br />
wand. Die meisten Verfahren basieren daher auf dem Einsatz <strong>von</strong> Farbstoffen <strong>und</strong> ei-<br />
ner optischen Auswertung. Häufig <strong>zur</strong> Auswertung <strong>von</strong> Trypanosomenkulturen ange-<br />
wandte Indikatoren sind z. B. 2’,7’-Bis-(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein-penta-<br />
acetoxy-methylester (BCECF-AM) <strong>und</strong> AlamarBlue [191, 217]. Erfahrungsberichte zei-<br />
gen, dass mit der AlamarBlue-Methode ein optimales Verfahren <strong>zur</strong> Bestimmung der<br />
Zellproliferation <strong>zur</strong> Verfügung steht [217]. Sie erfordert keine Extraktions-, Wasch-<br />
<strong>und</strong> Zentrifugationsschritte, ist somit zeitsparend <strong>und</strong> voll automatisierbar [6]. Ala-<br />
marBlue selbst ist wasserlöslich <strong>und</strong> nicht zytotoxisch [217]. Seine Anwendung auf<br />
Arzneistoff-exponierte Zellkulturen <strong>zur</strong> Auswertung des antitrypanosomalen Poten-<br />
zials entspricht in Bezug auf Zuverlässigkeit, Sensitivität, Reproduzierbarkeit, einfa-<br />
cher Handhabung <strong>und</strong> Finanzierbarkeit den Anforderungen eines High-Throughput-<br />
Screening-Verfahrens.<br />
4.1.2 AlamarBlue<br />
AlamarBlue gehört <strong>zur</strong> Gruppe der Reduktions-Oxidations(REDOX)-Indikatoren <strong>und</strong><br />
wirkt stoffwechselsensitiv. Es nutzt die Eigenschaft proliferierender Zellen das Verhält-<br />
nis zwischen reduzierter <strong>und</strong> oxidierter Form der Coenzyme NADPH/NADP,<br />
FADH/FAD, FMNH/FMN <strong>und</strong> NADH/NAD stetig zu vergrößern.<br />
O<br />
N +<br />
O O<br />
OH<br />
Resa<strong>zur</strong>in (ox.)<br />
Indigoblau<br />
Absorptionsmaximum: 600 nm<br />
NADPH, FADH, FMNH,<br />
NADH, Cytochrom<br />
N<br />
O O<br />
Abbildung 4.1: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Assay.<br />
OH<br />
Resorulfin (red.)<br />
Pink<br />
Absorptionsmaximum: 570 nm<br />
Im Gr<strong>und</strong>zustand liegt AlamarBlue in der oxidierten Form, als Resa<strong>zur</strong>in<br />
(λmax=600 nm) vor. Bei einem pH <strong>von</strong> 7 <strong>und</strong> bei 25 ◦ C besitzt es ein REDOX-Potenzial
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