Methoden zur Evaluation von ZytotoxizitÂ¨at und Struktur ... - OPUS

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180 7. Summary determination of the antibacterial activity of potential drugs. Therefore novel methods were developed based on capillary electrophoresis (CE) (Section 4.2) and nuclear magnetic resonance (NMR) (Section 4.4), which were suitable for the description of cell cultures and could be employed for activity screening. Having developed suitable CE-conditions, and optimized bacterial cultures and sam- ple preparation a reliable CE-method was established for the bacterial strains Strep- tococcus vestibularis and Pseudomonas fluorescens. The method was performed by UV detection and showed good precision, selectivity, specificity, and linearity. It allowed for separation of microbial agglomerates and chains of different size, and was used to create characteristic fingerprints. Staining bacteria by using the LIVE/DEAD BacLight viability kit the constitution of a bacterial population could be examined by means of LIF-CE. The kit consists of the two fluorescent nucleic acid stains SYTO9 and propidium iodide, which differ in their abili- ty to penetrate healthy cells making a distinction between live and dead cells possible: SYTO9 stains all cells green, propidium iodide stains cells with damaged membrane red. Monitoring electropherograms of bacterial samples by dual LIF detection, the ratio of live to dead cells was correlated with the electrophoretic profile. Therefore, the new LIF-CE method, based on the use of a second unlabeled bacteria injection as a stacking front, allowed for the direct observation of the tendency of chain formation and al- terations in the live/dead ratio of the bacterial composition in presence of different antibiotics. By correlation of the ratio of green and red fluorescence with the percenta- ge of live cells dose response curves of drug-treated bacterial samples were calculated, which allowed for the assessment of ED50 values. To verify the results the determination of the antibacterial activity was repeated by fluorescence microplate reader (FMR) measurements and broth microdilution method. For ciprofloxacin, ampicillin-Na, and vancomycin-HCl similar results were obtained for each of the three methods. The fluo- rometric methods allowed for a rapid differentiation between cytostatic and cytotoxic efficiency, which was previously not possible with broth microdilution. Using NMR experiments, it was shown by magnetic resonance imaging (MRI) at 17.6 T that the transverse relaxation T2 is suitable for the description of anaerobical, bacterial proliferation. The parameter T2, which is influenced by chemical exchange, is sensitive to all variations of the bacterial culture. Consumption of the medium, metabolism, and varying cell density change the composition and the concentration of medium as well as pH, ionic strength and viscosity. To establish the dependence of T2 on cell proliferation 1 H NMR spectra of Streptococcus vestibularis samples of different growth stages were correlated with the extracellular parameters T2, OD600, and pH. The consumption of medium and the pH-variation evoked by the production of metabolites during cell growth were identified to be the basis for the successful parametrization of cell growth by T2. MRI allowed for measuring growth curves on the basis of T2 of several
acterial cultures simultaneously. From T2-growth curves of Streptococcus vestibularis in the presence of varying concentrations of vancomycin, MIC of the antibiotic could be determined to be 0.33±0.08 µM. This value was in good agreement with the results obtained by conventional broth microdilution (MIC=0.7 µM), LIF-CE- (ED50= 0.24±0.07 µM), and FMR- (ED50=2.4±0.7 µM) method. 181
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