Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

116 4. Ergebnisse und Diskussion
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch
Fluoreszenzmarkierung
Überblick:
In diesem Abschnitt werden zwei neue Methoden zur Bestim-
mung der bakteriziden Wirksamkeit auf der Grundlage der Fluo-
reszenzspektroskopie entwickelt. Die Auswertung erfolgt sowohl
am Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (fluorescence micropla-
te reader, FMR) als auch mittels der in Abschnitt 4.2 beschrie-
benen kapillarelektrophoretischen Methode unter Verwendung ei-
nes Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektors (LIF-CE). Die Nutzung
der Membranunversehrtheit bei lebenden gegenüber toten Zel-
len ermöglicht nach Zellmarkierung mit den beiden Nucleinsäure-
bindenden Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid (”LI-
VE/DEAD BacLight viability kit”) schnell zwischen lebenden und to-
ten Zellen zu unterscheiden.
4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation
Zur Klassifizierung der antimikrobiellen Wirkung getesteter Substanzen in bakterizid
und statisch ist eine Analyse verschiedener Zellmerkmale notwendig. Konventionell
dient die Replikationsfähigkeit als Kriterium für die Prüfung auf Lebensfähigkeit. De-
ren Bestimmung in einer Zellkultur erfolgt meist durch Ausplattieren einer definierten
Menge Zellsuspension und anschließendem Zählen koloniebildender Einheiten [254].
Diese Methode hat jedoch durch Verklumpung der Zellen oder gegenseitiger Be-
einflussung bei der Koloniebildung [168] einige Fehlerquellen und ist nicht zu-
letzt sehr zeitintensiv (24 h bis 5 Tage) [254]. Auf der Suche nach neuen Lösungs-
ansätzen wurden in den letzten Jahren vor allem auf dem Gebiet der Fluores-
zenzspektroskopie verschiedene rasche Methoden zur Bestimmung der Lebensfähig-
keit entwickelt. Sie basieren zum einen auf der Membranunversehrtheit, die darauf
beruht, dass bestimmte Marker die Zellmembran nicht penetrieren können. Dazu
gehören Methylenblau, Kongo-Rot [227] und DNA-Marker wie SYTOX Green [157],
Propidiumiodid [135] und Ethidiumbromid [184]. Zum anderen wird die Aktivität
von Stoffwechselvorgängen gemessen wie z. B. Zellatmung (Tetrazoliumfarbstoffe
[8, 223]), Enzymaktivität (Fluoresceindiacetat [229, 247]), Membranpotenzial (Rhoda-
mine 123, DiOC6(3)(3,3-Dihexyloxacarbocyaniniodid) und DiBAC4 (Bis-(1,3-Dibutyl-
barbitursäure)-Trimethinoxonol) [138, 169]) oder pH-Gradient (Fluorescein und 5-
(und6-)-carboxyfluorescein [98]).