Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 85
CFU/nl
500
400
300
200
100
Micrococcus luteus
Pseudomonas fluorescens
Streptococcus vestibularis
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
OD 600
P. fluorescens die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße R 2 :
M. luteus : f(x) = 353.45 · x + 11.82, R 2 = 0.92
P. fluorescens : f(x) = 337.86 · x − 27.30, R 2 = 0.97
S. vestibularis : f(x) = 311.61 · x − 3.67, R 2 = 0.97
Abbildung 4.15: Korrelation
zwischen OD600-Werten und
Zellzahl.
Die schlechteste Korrelation zeigte M. luteus. Die Ursache hierfür liegt vermutlich in
seiner vielfältigen Clusterbildung, denn die dem Verfahren der CFU-Auszählung zu-
grundeliegende Erwartung, dass aus jeder vermehrungsfähigen Zelle eine makrosko-
pisch sichtbare Kolonie entsteht, trifft in diesem Fall nicht mehr zu und führt zu syste-
matischen Fehlern. Dennoch stellten diese Kalibriergeraden gute Anhaltspunkte dar
und dienten zur Berechnung der Zellzahl bei allen weiteren Experimenten.
4.2.5 Trenntechnik
Die spätere Weiterentwicklung der Methode zur Bestimmung von Zytotoxizität stellte
auch Anforderungen an die kapillarelektrophoretische Trenntechnik. In der Literatur
sind derzeit zwei Techniken für eine Mikroben-Analyse beschrieben: Kapillarzonen-
elektrophorese (CZE) und Kapillarisoelektrische Fokussierung (CIEF) (Abschnitt 3.4).
Während in der CZE die Trennung verschiedener Analyten auf Unterschieden in den
elektrophoretischen Mobilitäten basiert, werden die Bakterien in der CIEF aufgrund
ihrer amphoteren Oberfläche und somit nach dem isoelektrischen Punkt getrennt. Auf-
grund der zur Toxizitätsbestimmung notwendigen Zellmarkierung mittels SYTO9 und
Propidiumiodid zur Ermittlung des lebend/tot-Verhältnisses der Bakterienpopulati-
on, war eine Auswirkung auf den isoelektrischen Punkt nicht auszuschließen, so dass
die CZE der CIEF als Trenntechnik vorgezogen wurde. Ferner sollten die verwendeten
Kapillaren beschichtet sein, um: