Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

5.1 Bakteriologische Untersuchungen 165
sung durch die Zellen vernachlässigt werden. In der T2-Karte wurde für jedes 5 mm-
NMR-Röhrchen ein ROI (region of interest) mit durchschnittlich 140 Pixeln definiert
und T2 als Mittelwert in den ROIs bestimmt. In die gemessenen T2-Werte gehen unter
anderem Diffusionseffekte mit ein. Aufgrund konstanter experimenteller Parameter
während einer Messserie, wurde der Einfluss der Diffusion als konstant angenommen
und T2 als gemessenes T2 definiert.
5.1.5.2 Spektroskopie
Die NMR-Spektren der Bakteriensuspensionen wurden am 9.4 T Bruker-Avance-NMR-
Spektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) gemessen. Verwen-
det wurde dabei ein BBO(Broadband Observe)-Probenkopf mit Z-Gradientensystem.
Jede Bakterienprobe enthielt 10 % D2O zur Setzung des Locksignals.
5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie
Die Messungen erfolgten unter Verwendung von Watergate-W5-Wasserunterdrück-
ungspulsen und wurden bei 300 K mit den folgenden Parametern durchgeführt: Punk-
te, 64 K; Anzahl der Mittlungen, 64; Spektrale Breite, 16 ppm; Akquisitionszeit, 5.1 s
und Relaxationsdelay, 2 s. Die Quantifizierung erfolgte durch Integration der Flächen
unter den Protonensignalen. Maleinsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml diente
als interner Standard (δ=6.2 ppm), dessen Fläche unter der Kurve auf eins normiert
wurde.
5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie
2D-Doppelquanten-gefilterte-COSY-Experimente wurden bei 300 K unter Verwen-
dung von 3-9-19 Wasserunterdrückungspulsen (Watergate) und mit den folgenden Pa-
rametern durchgeführt: Punkte, 2048 K; Anzahl der Mittlungen, 80; Spektrale Breite,
12.32 ppm; Akquisitionszeit, 0.208 s; Relaxationsdelay, 2 s; Inkremente von t1, 256.
5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid
Der “Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit” (L-7012) zur Markierung lebender
und toter Bakterienzellen wurde über Molecular Probes (MobiTec, Göttingen, Deutsch-
land) bezogen. Er besteht aus den beiden Fluoreszenzfarbstoffen SYTO9 und Propidi-
umiodid. SYTO9 liegt in 3.34 mM, Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, gelöst in
DMSO, vor. Für die Verwendung in den Zytotoxizitätsbestimmungen wurden diese
Stammlösungen mit DMSO 1:10 bzw. 1:100 verdünnt. Die Anregungs-/Emissionsma-
xima für diese Farbstoffe liegen für SYTO9 bei 480/500 nm und bei 490/635 nm für
Propidiumiodid. Die zwei Nucleinsäure-bindenden Farbstoffe unterscheiden sich in