Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

128 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.47: ” Vitalitätsgeraden”
von P. fluorescens und S. vestibularis
aus der Mittelung über
vier Wiederholexperimente. Die
Zellmarkierung von 1.5 x 10 6
Zellen/ml erfolgte mit 0.167 µM
SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid.
Gemessen wurde an der
LIF-CE bei einer Anregungswellenlänge
von 488 nm und dualer
Emission bei 520 nm und
ratio of green/red fluorescence
25
20
15
10
5
P. fluorescens
S. vestibularis
0
0 20 40 60 80 100
655 nm. percentage of live cells
Wie bei der FMR-Methode wurde die Korrelation zwischen dem grün/roten Fluores-
zenzverhältnis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen insgesamt viermal ge-
messen. Für die Streuung der einzelnen Messergebnisse ergab sich eine relative Stan-
dardabweichung von ≤ 18% für P. fluorescens und ≤ 12% für S. vestibularis. Vermutlich
verursacht die geringe Probenmenge die im Vergleich zur FMR-Methode (P. fluorescens
≤ 8% ,S. vestibularis ≤ 4%) höheren Standardabweichungen.
Die angemessenen R 2 -Werte sind jedoch ein Indiz dafür, dass die unmarkierten Zel-
len der zweiten Injektion lediglich als “stacking front” dienen und durch überschüssi-
ge Fluoreszenzmarker nicht wesentlich beeinflusst werden. Eine genaue Überprüfung
durch Waschen der markierten Zellen zur Entfernung überschüssiger Fluoreszenzmar-
ker war jedoch aufgrund der geringen Zellmenge selbst mittels Ultrazentrifugation
nicht möglich.
4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE
Vergleicht man das optimale Markerverhältnis der FMR- und der LIF-CE-Methode
miteinander, so ist bei der LIF-CE-Methode bezogen auf die gleiche Zellzahl die 100-
fache Propidiumiodid-Konzentration notwendig. Ursache liegt vermutlich in der un-
terschiedlichen Art der Detektion. Beim FMR wird die gesamte Fluoreszenz aus einem
Gesamtvolumen von 200 µl in einer Vertiefung mit einem Durchmesser von 0.8 cm er-
fasst. Dadurch liefert die Hintergrundfluoreszenz den größten Beitrag zur detektierten
Lichtintensität, wenn man berücksichtigt, dass bei einem durchschnittlichen Zellradi-
us von 0.5 µm die Bakterienzellen eine Volumenfraktion von unter 10 −5 besetzen. Für
die Messungen von rein mit SYTO9 markierten Zellen fällt der extrazelluläre Beitrag
aufgrund der verstärkten Fluoreszenzintensität von SYTO9 bei DNA-Bindung weni-
ger stark ins Gewicht. Propidiumiodid jedoch zeigt bei DNA-Bindung im Vergleich
zur frei vorliegenden Form nur eine geringfügig höhere Intensität [28, 254], so dass
die detektierte Emission stark von der Hintergrundfluoreszenz abhängt, wodurch zum