Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 127
4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung
4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung
Die Validierung der Markerkonzentration und des Verhältnisses beider Marker in der
LIF-CE-Methode geschah auf der Grundlage der Ergebnisse der FMR-Methode. Die
zur Sättigung einer Zellkonzentration von 1.5 x 10 7 Zellen/ml eingesetzte SYTO9-
Konzentration von 1.67 µM wurde 1:10 verdünnt und in der LIF-CE-Methode ange-
wandt, zumal die zur Fokussierung notwendige zweite Injektion unmarkierter Zel-
len die direkte Bestimmung der Markersättigung verhinderte. Dagegen konnte die
” richtige” Propidiumiodid-Konzentration durch Prüfung der Korrelation zwischen
grün/roter Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen auf Linearität
neu ermittelt werden.
Für eine lineare Korrelation zwischen dem Verhältnis grün/roter Fluoreszenz und dem
prozentualen Anteil lebender Zellen wurden 1.5 x 10 6 Zellen/ml mit 0.167 µM SYTO9
und 100 µM Propidiumiodid für 15 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert.
Die entsprechenden Elektropherogramme wurden für P. fluorescens und S. vestibularis
unter Verwendung einer Nachinjektion unmarkierter Bakterien in einer Konzentra-
tion von 0.5 OD600 im Zwei-Kanal-Modus des Argon-Laser-induzierten-Fluoreszenz-
Detektors bei 520 nm und 655 nm aufgezeichnet und sind in Abbildung 4.48 und Ab-
bildung 4.49 dargestellt. Sie enthalten
• den Anteil lebender Zellen bei 520 nm,
• den Anteil toter Zellen bei 655 nm,
• die spektrale Überlappung von SYTO9 und Propidiumiodid und
• nahezu keine Hintergrundfluoreszenz.
Ihre Auswertung erfolgte durch Integration aller Signale über das gesamte aufgezeich-
nete Zeitfenster. Die Änderungen der elektrophoretischen Fingerabdrücke je nach Zu-
stand einer Bakterienpopulation werden im nächsten Abschnitt diskutiert. In Abbild-
ung 4.47 sind die zur Kalibrierung der Vitalität bestimmten ” Vitalitätsgeraden” von P.
fluorescens und S. vestibularis abgebildet. Für die Korrelationsfunktion f(x) = ax + b
ergaben sich folgende Geradengleichungen und Bestimmtheitsmaße:
P. fluorescens : f(x) = 4.71 · x + 0.43, R 2 = 0.981
S. vestibularis : f(x) = 22.38 · x + 0.56, R 2 = 0.996