Methoden zur Evaluation von ZytotoxizitÂ¨at und Struktur ... - OPUS

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138 4. Ergebnisse und Diskussion te Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit des Ciprofloxacins unter der Verwen- dung von 0.1 M NaOH und DMSO als Lösungsmittel bestätigt werden. Abbildung 4.55: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen. Ofloxacin ist in der Stammlösung in 0.1 M NaOH gelöst. Durch Verdünnung mit Medium befinden sich in den Zellinokula ledig1ich 1 % 0.1 M NaOH. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-System bei einer Emissionswellenlänge von (A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Für CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung 4.46.
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 139 4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilität-Ausblick Die Fluoreszenzmarkierung Arzneistoff-exponierter Bakterienkulturen mit den beiden Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid ermöglicht eine schnelle, differenzierte Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit. Die beiden fluorimetrischen Me- thoden mittels FMR und LIF-CE können im Gegensatz zum konventionell, im HTS an- gewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 schnell zwischen zytotoxischer und zytostatischer Wirkung unterscheiden. Dennoch sind die fluorimetrischen Metho- den eher zur Ergänzung als zur Substitution des Mikrodilutionsverfahrens geeignet. Zwar erfüllt die LIF-CE-Methode die Voraussetzung der Miniaturisierung, doch er- weisen sich Parallelisierung und Automatisierung, die Schlüsselworte für Verfahren mit hohem Durchsatz aufgrund einiger Waschschritte als schwierig. Das Potenzial der LIF-CE-Methode besteht darin, dass aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakteri- enprobe aufgrund verschiedener Aggregate unterschiedlicher Größe Rückschlüsse auf die Bakterienkonstitution unter Exposition eines Antibiotikums gezogen werden kann. Dies verhindert jedoch die simultane Analyse verschiedener Bakterien-Spezies. Den- noch eignet sich vor allem die LIF-CE-Methode aufgrund ihrer hohen Aussagekraft auch bezüglich der Erkennung von Lösungsmittelinkompatibilitäten als ergänzende Methode zum Mikrodilutionsverfahren im HTS und erlaubt eine differenzierte Akti- vitätsbestimmung innerhalb von 30 Minuten. 4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays” • Die beiden neuen fluorimetrischen Zytotoxizitäts-Assays mittels FMR und LIF- CE stellen eine gute Ergänzung zum konventionellen Mikrodilutionsverfahren dar und verhindern das zeitaufwändige Zählen koloniebildender Einheiten. • Die Korrelation der grün/rot-Fluoreszenzverhältnisse mit dem prozentualen An- teil lebender Zellen erlaubt eine schnelle Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven und die Berechnung von ED50-Werten. • Die neue LIF-CE-Methode gelang unter Verwendung einer “stacking front” durch Nachinjektion unmarkierter Zellen und lässt aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakterienkultur Rückschlüsse auf die Zytotoxizität einer Testsub- stanz zu, wodurch ein neuer Ansatzpunkt für Testverfahren offensteht. • Inkompatibilitäten zwischen Bakterien, Lösungsmittel und Arzneistoff limitie- ren den Anwendungsbereich der beiden Methoden, können aber mittels LIF-CE erkannt werden.
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