Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

120 4. Ergebnisse und Diskussion
4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR)
4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung
In der Fluoreszenzspektroskopie wird die gesamte Lumineszenz einer Probe gemes-
sen. Sie muss folglich proportional zur vorhandenen Zellzahl sein, d. h. alle Bakteri-
enzellen müssen mit Farbstoff gesättigt sein. Aufgrund der gegenseitigen Beeinflus-
sung der beiden Fluoreszenzmarker SYTO9 und Propidiumiodid durch Verdrängung
und Fluoreszenzlöschung bildet die Sättigung der Probe mit SYTO9 die Grundlage der
fluorimetrischen Auswertung. Ferner muss für eine korrekte Fluoreszenzmarkierung
und Auswertung Propidiumiodid in ausreichendem Überschuss vorhanden sein, so
dass die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration erst durch die ” Herstellung” ei-
ner Korrelation 1. Ordnung (vide infra) zwischen dem grün/roten Fluoreszenzverhält-
nis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen angepasst werden kann [4, 254]. Die
Bestimmung der erforderlichen Konzentrationen erfolgte zunächst am FMR bei einer
Anregungswellenlänge von 488 nm und Emissionswellenlängen von 520 nm (SYTO9)
und 655 nm (Propidiumiodid). Diese entsprachen zwar nicht den Anregungs- und
Emissionsmaxima, doch bestand dadurch Einklang mit den Techniken der Fluores-
zenzmikroskopie, die zu Visualisierungszwecken eingesetzt wurde, und der LIF-CE.
4.3.4.1.1 Sättigungskonzentration
Die Sättigungskonzentration von SYTO9 wurde für eine Bakterienpopulation in der
frühen stationären Phase bestimmt. In diesem Stadium, kurz nach Abschließen des
Zellwachstums besteht eine Bakterienkultur aus fast 100 % lebenden Zellen. Die ver-
wendeten Bakterienzellen waren in 200 µl Wasser suspendiert, um eine mögliche
Bindung von SYTO9 an Mediumbestandteile auszuschließen. In Vorversuchen wur-
den unterschiedliche Zellkonzentrationen zur Zellmarkierung eingesetzt. Eine Fluo-
reszenzmarkierung von 1.5 x 10 7 Zellen/ml (1:10 Verdünnung einer 0.5 OD600-Stamm-
lösung, siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) führte zu einer Fluoreszenzin-
tensität im Bereich 100 bis 200 RFU (relative fluorescence unit) und erwies sich so-
mit als geeignet für alle nachfolgenden Experimente. Abbildung 4.42 zeigt die Fluo-
reszenzintensitäten von acht Pseudomonas-Proben, die zuvor mit unterschiedlichen
SYTO9-Konzentrationen in einem Konzentrationsbereich zwischen 15 nM und 10 µM
unter Lichtausschluss für 15 Minuten inkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensität der
markierten Pseudomonas-Proben steigt als Funktion der SYTO9-Konzentration um
mehr als das Doppelte. Bei einer Konzentration von > 1.5 µM stagniert die Fluores-
zenzintensität und mündet in einem Plateau, das die Sättigung der Zellen mit SYTO9
markiert. Ein Vergleich zu den ungebundenen SYTO9-Intensitäten, die in rein wässri-
ger Umgebung gemessen wurden, verdeutlicht die starke Fluoreszenz des DNA-
gebundenen SYTO9. Für S. vestibularis ergab sich bei ähnlichem Fluoreszenzverhalten