Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 121
green fluorescent intensity [RFU]
250
200
150
100
50
7
SYTO9 + 1.5x10 Zellen/ml
SYTO9 ohne Zellen
0
0 2 4 6 8 10
Concentration SYTO9 [ µ M]
eine identische Sättigungskonzentration.
Abbildung 4.42: Sättigungskurve
von P. fluorescens für den
Fluoreszenzmarker SYTO9.
Die verwendeten Bakteriensuspensionen
enthalten 1.5 x
10 7 Zellen/ml aus der frühen
stationären Phase in wässrigem
Milieu. Die Messungen erfolgten
am FMR bei einer Anregungswellenlänge
von 488 nm und
einer Emission von 520 nm.
Für alle weiteren Messungen wurde zur Sättigung von 1.5 x 10 7 Zellen/ml eine SYTO9-
Konzentration von 1.67 µM eingesetzt.
4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung
Im zweiten Schritt wurde die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration auf der Ba-
sis der optimierten SYTO9-Konzentration eingestellt. Dazu wurden zwei Zellsuspen-
sionen bestehend aus je 100 % lebenden und toten Zellen mit einem OD600-Wert von
0.5 präpariert, 1:10 verdünnt, so dass sich eine Gesamtzellzahl von 1.5 x 10 7 Zellen/ml
ergab, und in fünf unterschiedlichen lebend/tot-Verhältnissen gemischt: 100:0, 75:25,
50:50, 25:75, und 0:100. Die exakte Herstellung dieser Referenzsuspensionen und die
Abtötung der Bakterienzellen mit Isopropanol ist im Experimentellen Teil Abschnitt
5.1.7.2.5 beschrieben. Ist das zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzte Verhältnis zwi-
schen SYTO9 und Propidiumiodid ” richtig”, dann beschreibt eine Korrelationsfunk-
tion 1. Ordnung die Beziehung zwischen dem Verhältnis grüner zu roter Fluores-
zenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen. Unterschiedliche Propidiumiodid-
Konzentrationen im Bereich 1 bis 100 µM wurden somit auf Linearität getestet. Ab-
bildung 4.43 zeigt am Beispiel der SYTO9-markierten Pseudomonas-Spezies die er-
haltenen ” Vitalitätskurven” in Abhängigkeit von der eingesetzten Propidiumiodid-
Konzentration.