Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 137
FMR-Methode eine Abweichung von einer 10er Potenz, was jedoch immer noch im
Rahmen der üblichen Streuungen bei In-vitro-Testverfahren [175] liegt. Dagegen wur-
den bei Ofloxacin gegen P. fluorescens mit dem “BacLight viability kit” sowohl mit der
FMR- als auch der LIF-CE-Methode irreführende hohe ED50-Konzentrationen erhalten.
Ofloxacin Ciprofloxacin Ampicillin-Na Vancomycin-HCl
in 0.1 M NaOH in H2O in H2O in H2O
ED50 (FMR) >100 5.1±1.6 5.8±1.6 2.4±0.7
ED50 (LIF-CE) >100 1.9±1.0 9.5±1.5 0.2±0.07
MIC 3.0 3.0 0.7 0.7
Tabelle 4.6: Ergebnisse der antibiotischen Wirksamkeit von Ofloxacin, Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und
Vancomycin-HCl. Bestimmt wurden die Ergebnisse mittels FMR, LIF-CE und Mikrodilutionsverfahren.
Die Zahlenwerte sind in µM angegeben und beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die
Messungen mittels FMR und LIF-CE wurden zweimal wiederholt, während die MIC-Werte einmal bestimmt
wurden. Ofloxacin und Ciprofloxacin wurden gegen P. fluorescens getestet. Ampicillin-Na und
Vancomycin-HCl gegen S. vestibularis.
Mehr Aufschluss über das Versagen der fluorimetrischen Methoden am Beispiel Oflo-
xacin brachten die entsprechenden elektrophoretischen Fingerabdrücke bei 520 und
655 nm. In Abbildung 4.55 sind die Elektropherogramme von P. fluorescens nach Expo-
sition mit unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen zusammen mit einer Positiv-
kontrolle abgebildet. Für niedrige Ofloxacin-Konzentrationen im Bereich 0.01 bis 0.1
µM, weisen die Elektropherogramme das charakteristische Lebend-Muster auf, d. h.
ein großes Signal bei einer Migrationszeit von ca. 10 Minuten dominiert die Elektro-
pherogramme bei 520 nm (Abbildung 4.55(A)) während die Peakmuster bei 655 nm ei-
ne verminderte Fluoreszenzintensität aufweisen (Abbildung 4.55(B)). Mit ansteigender
Ofloxacin-Konzentration nimmt die Fluoreszenzintensität der Signale der Ketten bei
655 nm mehr und mehr zu (Abbildung 4.55(B)), gleichzeitig nimmt die Fluoreszenz-
emission des Einzel-Zell-Signals bei 520 nm immer mehr ab (Abbildung 4.55(A)) und
das charakteristische Tot-Muster erscheint bei einer 10 µM Lösung. Bei einer Ofloxacin-
Konzentration von 100 µM verschwindet dieses Muster jedoch und nimmt eine vitale
Populationscharakteristik an. Die Vermutung liegt nahe, dass dieser Effekt lösungs-
mittelbedingt ist. Wahrscheinlich kumuliert bei dieser Konzentration der zytotoxische
Effekt des Antibiotikums mit dem der 1 %igen 0.1 M NaOH-Lösung (durch den Einsatz
10 mM Antibiotika-Stammlösungen befindet sich bei der Testung nur 1 % des Lösungs-
mittels in der Bakterienkultur, siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) und ver-
ursacht das Lysieren der Bakterienzellen, wodurch ein falsches grün/rot-Verhältnis
beobachtet wird. Ähnliche Resultate ergaben sich auch bei Einsatz von DMSO als
Lösungsmittel. Die Hypothese der zytotoxischen Kumulation konnte durch die erneu-