Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 139
4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilität-Ausblick
Die Fluoreszenzmarkierung Arzneistoff-exponierter Bakterienkulturen mit den beiden
Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid ermöglicht eine schnelle, differen-
zierte Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit. Die beiden fluorimetrischen Me-
thoden mittels FMR und LIF-CE können im Gegensatz zum konventionell, im HTS an-
gewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 schnell zwischen zytotoxischer
und zytostatischer Wirkung unterscheiden. Dennoch sind die fluorimetrischen Metho-
den eher zur Ergänzung als zur Substitution des Mikrodilutionsverfahrens geeignet.
Zwar erfüllt die LIF-CE-Methode die Voraussetzung der Miniaturisierung, doch er-
weisen sich Parallelisierung und Automatisierung, die Schlüsselworte für Verfahren
mit hohem Durchsatz aufgrund einiger Waschschritte als schwierig. Das Potenzial der
LIF-CE-Methode besteht darin, dass aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakteri-
enprobe aufgrund verschiedener Aggregate unterschiedlicher Größe Rückschlüsse auf
die Bakterienkonstitution unter Exposition eines Antibiotikums gezogen werden kann.
Dies verhindert jedoch die simultane Analyse verschiedener Bakterien-Spezies. Den-
noch eignet sich vor allem die LIF-CE-Methode aufgrund ihrer hohen Aussagekraft
auch bezüglich der Erkennung von Lösungsmittelinkompatibilitäten als ergänzende
Methode zum Mikrodilutionsverfahren im HTS und erlaubt eine differenzierte Akti-
vitätsbestimmung innerhalb von 30 Minuten.
4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays”
• Die beiden neuen fluorimetrischen Zytotoxizitäts-Assays mittels FMR und LIF-
CE stellen eine gute Ergänzung zum konventionellen Mikrodilutionsverfahren
dar und verhindern das zeitaufwändige Zählen koloniebildender Einheiten.
• Die Korrelation der grün/rot-Fluoreszenzverhältnisse mit dem prozentualen An-
teil lebender Zellen erlaubt eine schnelle Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven
und die Berechnung von ED50-Werten.
• Die neue LIF-CE-Methode gelang unter Verwendung einer “stacking front”
durch Nachinjektion unmarkierter Zellen und lässt aus dem elektrophoretischen
Profil einer Bakterienkultur Rückschlüsse auf die Zytotoxizität einer Testsub-
stanz zu, wodurch ein neuer Ansatzpunkt für Testverfahren offensteht.
• Inkompatibilitäten zwischen Bakterien, Lösungsmittel und Arzneistoff limitie-
ren den Anwendungsbereich der beiden Methoden, können aber mittels LIF-CE
erkannt werden.