Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

98 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.24: Messung einer
M. luteus-Probe (a) ohne
einminütigem Vortexen (b) mit
einminütiger Ultraschallbehandlung
(c) mit einminütigem Vortexen
vor der Injektion. Die Bakterienproben
wurden nach einer
Inkubationszeit von 24 h
präpariert, in H2O gewaschen
und in einer Konzentration von
0.5 OD600 in Trennpuffer resuspendiert.
Für Trennpuffer und
CE-Bedingungen, siehe Abbildung
4.21.
durch einminütiges Vortexen erreicht werden. Eine Ultraschallbehandlung führte da-
gegen in unserem Experiment zur Dispersion der Aggregate. Unter Verwendung eines
5 mM Phosphat-Puffers beobachteten Buszewski et al. [53] bereits durch Schütteln der
Bakterienprobe eine Zunahme an Einzelzellen. Die Auswirkung verschiedener Vorbe-
handlungen auf die Zellpopulation scheint somit extrem von den die Bakterienzellen
umgebenden Elektrolyten abhängig zu sein.
⇒ Optimierte Probenpräparation: Reinigung der Bakterienzellen von Medium in
Millipore-Wasser; Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer durch einminütiges Vor-
texen.
4.2.6.3.4 Probenkonzentration
Routinemessungen zeigten, dass die CE-Methode hohe Zellkonzentrationen erfordert.
In Abbildung 4.25a sind die elektrophoretischen Fingerabdrücke von M. luteus in Ab-
hängigkeit der Konzentration dargestellt. Im Falle geringer Bakterienkonzentrationen,
d. h. im OD600-Bereich zwischen 0.2 und 0.3 (Zellkonzentration: 9 x 10 7 - 14 x 10 7 Zel-
len/ml, Elektropherogramme A und B in Abbildung 4.25a), ist nur ein Signal mit
Migrationszeiten über 15 Minuten detektierbar. Mit zunehmender Zellkonzentration
werden die Peaks schmaler und zahlreicher, einhergehend mit kürzeren Migrations-
zeiten (Elektropherogramm C). Die Elektropherogramme D und E spiegeln bei einer
Zellkonzentration ≥ 0.5 OD600 (≥2.3 x 10 8 Zellen/ml) die vielfältigen Cluster in der
Bakterienpopulation wider, wobei bei einer Konzentration von 0.6 OD600 bereits durch
Überladung der Kapillare Peakverbreiterungen auftreten.
Ähnliche Resultate wurden durch Variation der Injektionszeiten bei 0.5 psi und einer
Zellkonzentration von 0.5 OD600 erreicht. In Abbildung 4.25b sind die entsprechenden
Elektropherogramme nach einer Injektionszeit von 1, 4, 7, 10 und 13 Sekunden dar-