Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

168 5. Experimenteller Teil
5.1.7.2.5 Zellpräparation und Stammsuspensionen zur kapillarelektrophoretischen und fluo-
reszenzspektroskopischen Analyse
20 µl einer 12h-Bakterienkultur wurden in 2 ml BHI-Bouillon suspendiert und in 15 ml-
Röhrchen bei 30 ◦ C für 24 h bis zum Erreichen der frühen stationären Phase inkubiert.
Die Bakteriensuspension wurde in einer Zentrifuge (EBA 12; Hettich, Kirchlengern,
Deutschland) bei 3400 rpm für 5 min pelletiert. Der Überstand wurde abdekantiert,
die Zellen mit 500 µl Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach zweimaligem
Waschen wurden die Zellen entweder in Wasser (fluorimetrische Bestimmungen) oder
in Trennpuffer (CE-Bestimmungen) resuspendiert. Aufgrund der Bakterienernte in der
frühen stationären Phase, stellen die Bakterien in diesem Zustand nahezu 100 % le-
bende Zellen dar. Für die Kalibrierung des zur Zellmarkierung erforderlichen Kon-
zentrationsverhältnisses von SYTO9 und Propidiumiodid waren Bakterienproben mit
unterschiedlichem Gehalt an lebenden und toten Zellen erforderlich. Zur Herstellung
einer Bakteriensuspension mit 100 %igem Tot-Anteil wurden gewaschene Zellen für
eine Stunde in 50 %igem Isopropanol suspendiert und nach einem Waschschritt ent-
weder in Wasser (fluorimetrische Bestimmung) oder Trennpuffer (CE-Bestimmung)
überführt. Die Stammbakteriensuspensionen lebender und toter Zellen wurden auf
eine OD600-Wert von 0.5 eingestellt und unmittelbar vor jeder Messung präpariert.
Diese Zellkonzentration wurde für CE-Messungen mit UV-Detektion bei 214 nm ver-
wendet. Fluoreszenz-Messungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät oder an der
Kapillarelektrophorese wurden mit 1:10 (Fluorimeter) bzw. 1:100 (LIF-CE) verdünnten
Bakterienproben durchgeführt. Die Entwicklung eines Zytotoxizitätstests mittels LIF-
CE und Fluorimeter erforderte Arzneistoff-behandelte Bakterienproben. Dazu wurden
1980 µl einer sich in der exponentiellen Phase befindlichen Bakterienkultur in BHI-
Medium (OD600=0.3) in fünf 15 ml Zentrifugenröhrchen aliquotiert. Die Zugabe von 20
µl verschiedener Konzentrationen einer 10fachen Verdünnungsreihe der Antibiotika-
Stammlösungen mit den entsprechenden Lösungsmitteln führte zu einem Testbereich
von 0.01 µM bis 100 µM an Antibiotika-Konzentration unter Verwendung von 1 %
Lösungsmittel (vgl. Abschnitt 5.2.5). Zusammen mit einer Positivkontrolle (Inokulum
mit 1 % Lösungsmittel) wurden die Ansätze bei 30 ◦ C für 18 h inkubiert, d. h. so lan-
ge, bis unbeeinflusste Bakterienproben den stationären Zustand erreichten. Anschlie-
ßend wurden die Bakterienzellen geerntet, wie zuvor beschrieben, gewaschen, in Was-
ser bzw. in Trennpuffer in den entsprechenden Konzentrationen suspendiert, und für
Fluoreszenz-Messungen verwendet.
5.1.7.2.6 Zellpräparation und Stammsuspensionen für die NMR-Messungen
20 µl einer 12h-Kultur wurden in 2.0 ml BHI-Medium suspendiert und in 5 mm-NMR-
Röhrchen überführt. Das Inokulum zeigte einen OD600-Wert von 0.015. Zur Bestim-