Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

5.1 Bakteriologische Untersuchungen 169
mung der T2-Wachstumskurven wurden diese Proben über einen Zeitraum von 24 h
gemessen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) erfolgte durch
Messung von T2-Wachstumskurven in Abhängigkeit unterschiedlicher Antibiotika-
Konzentrationen. Dazu wurden 1.980 µl Bakteriensuspension mit einem OD600-Wert
von ca. 0.015 in fünf 5 mm-NMR-Röhrchen aliquotiert und mit 20 µl einer Antibiotika-
Stammlösung bzw. -Arbeitslösung versetzt, so dass sich eine Testkonzentration zwi-
schen 100 µM und 0.01 µM unter Verwendung von 1 % Lösungsmittel ergab.
5.1.8 Zytotoxizität
5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR)
200 µl Arzneistoff-behandelter Bakterienproben (Abschnitt 5.1.7.2.5), die zuvor auf
einen OD600-Wert von 0.5 eingestellt und anschließend 1:10 verdünnt wurden (ca. 10 7
Zellen/ml), wurden in die Vertiefungen einer weißen Mikrotiterplatte gegeben. Die
Zellmarkierung erfolgte durch hinzufügen von je 1 µl 0.33 mM SYTO9 und 2 mM Pro-
pidiumiodid und anschließender Inkubation von 15 Minuten unter Lichtausschluss.
Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät bei einer An-
regungswellenlänge von 488 nm und Zwei-Kanal-Emission bei 520 nm (grün, lebend)
und 655 nm (rot, tot) ausgelesen. Durch Vergleich mit einer Standard-Lebendigkeits-
Kurve (beschreibt die Beziehung zwischen den Verhältnissen grün/roter Fluores-
zenzintensitäten und unterschiedlichen Verhältnissen lebender zu toter Zellen) konnte
das Verhältnis grün/rot für jede Konzentration einer getesteten Substanz mit dem pro-
zentualen Anteil lebender Zellen korreliert werden. Die Testung einer Substanz wurde
zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Aktivität der getesteten Substanzen er-
folgte durch Berechnung von ED50-Werten (Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolati-
on.
5.1.8.2 LIF-CE
200 µl einer Arzneistoff-behandelten Bakteriensuspension (Abschnitt 5.1.7.2.5) wurde
auf einen OD600-Wert von 0.5 eingestellt, anschließend 1:100 verdünnt (ca. 10 6 Zel-
len/ml) und mit jeweils 1 µl von 0.033 mM SYTO9- und 20 mM Propidiumiodid-
Lösung versetzt. Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte für 15 Minuten unter Lichtaus-
schluss. Die markierten Bakterienproben wurden an der Anode der Kapillare injiziert
durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi für eine Dauer von 10 s. Um die Peaks
der niedrig konzentrierten Bakterienproben fokussieren zu können, folgte der Proben-
injektion eine zweite Injektion aus einer unmarkierten Bakteriensuspension höher-
er Konzentration (OD600=0.5; d. h. ca. 10 8 Zellen/ml), ebenfalls durch Anlegen eines
Druckes von 0.5 psi für 10 s. Die Elektropherogramme wurden mit einer Anregungs-