Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS
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28 2. Problemstellung <strong>und</strong> Ziele der Arbeit<br />
dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (capillary elektrophoresis, CE) <strong>und</strong> der ma-<br />
gnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) <strong>zur</strong> Entwicklung neuer<br />
“in-vitro-whole-cell-bioassays” genutzt werden.<br />
Ziel war es Alternativen <strong>und</strong> Ergänzungen zum Mikrodilutionsverfahren nach DIN<br />
(DIN 58940), dem konventionell <strong>zur</strong> Testung an Bakterien angewandten High-<br />
Throughput-Verfahren, zu entwickeln. Dieses Verfahren beruht ausschließlich auf der<br />
Bestimmung der Gesamtzellzahl einer Bakterienkultur unter Exposition verschiedener<br />
Testsubstanzen mittels optischer Detektion <strong>und</strong> erlaubt keine Aussage über die Art der<br />
antimikrobiellen Wirkung . Erst in einem zeitaufwändigen zweiten Schritt kann durch<br />
Auszählen koloniebildender Einheiten zwischen bakteriostatischer <strong>und</strong> bakterizider<br />
Wirksamkeit unterschieden werden.<br />
In der Kapillarelektrophorese boten vor allem die Arbeiten <strong>von</strong> Armstrong <strong>und</strong> Mit-<br />
arbeitern neue Perspektiven [13–15, 77, 240]. Es gelang sowohl die simultane kapil-<br />
larelektrophoretische Trennung, Identifizierung, Quantifizierung <strong>und</strong> Charakterisie-<br />
rung <strong>von</strong> Bakterien <strong>und</strong> deren Agglomeraten, ohne die Mikroben bei der Messung<br />
signifikant zu schädigen [86], als auch die Aufzeichnung der Elektropherogramme<br />
mittels Fluoreszenz-Detektion <strong>zur</strong> Unterscheidung lebender <strong>und</strong> toter Bakterienzellen<br />
nach Zellmarkierung mit SYTO9 <strong>und</strong> Propidiumiodid. Mit der Kapillarelektrophorese<br />
bestand somit ein Potenzial, durch Trennung <strong>von</strong> Agglomeraten <strong>und</strong> Ketten unter-<br />
schiedlicher Größe bakterienspezifische “fingerprints” zu erstellen <strong>und</strong> deren Ände-<br />
rung unter dem Einfluss zytotoxischer Substanzen im Kontext mit der lebend/tot-<br />
Rate der Bakterienpopulation zu diskutieren. Dadurch könnte innerhalb 15 Minuten<br />
die Wirksamkeit der Testsubstanzen differenziert bestimmt werden. Da die CE Mi-<br />
kroben gleichzeitig trennen <strong>und</strong> quantifizieren kann, sollte der Einfluss antiinfektiver<br />
Wirksubstanzen in einem Ansatz messbar sein, wodurch der Durchsatz des Testverfah-<br />
rens erheblich gesteigert werden kann. Da bisher die antibiotische Wirksamkeit mittels<br />
SYTO9- <strong>und</strong> Propidiumiodid-Markierung noch nicht bestimmt worden ist, waren Mes-<br />
sungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät (FMR) mit eingeschlossen.<br />
Der Aufbau des Test-Verfahrens auf der Gr<strong>und</strong>lage der CE implizierte:<br />
• Die zielorientierte Auswahl verschiedener Bakterienspezies <strong>und</strong> deren Kul-<br />
turaufbau.<br />
• Die Untersuchung elektrophoretischer Eigenschaften <strong>von</strong> Mikroben <strong>und</strong> die<br />
Analyse physikalisch-chemischer Einflussfaktoren zum Verständnis der kapillar-<br />
elektrophoretischen Mikroben-Analyse. Da zu diesem Zeitpunkt im Arbeitskreis<br />
noch keine Erfahrung in der kapillarelektrophoretischen Charakterisierung <strong>von</strong><br />
Biokolloiden bestand, musste zunächst eine dafür geeignete CE-Methode eta-<br />
bliert werden.
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