Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Aus dem Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie
der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. U. Walter
Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
vorgelegt von
Jochen Brich
aus Ansbach
Würzburg, Februar 2004

Referent: Prof. Dr. med. U. Walter
Korreferent: Priv.-Doz. Dr. med. J. Bauersachs
Dekan: Prof. Dr. med. S. Silbernagl
Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2004
Der Promovend ist Arzt.

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Aktivierung von Thrombozyten 2
1.1.1 Aktivierung durch membranständige Proteine 2
1.1.2 Aktivierung durch lösliche Agonisten 3
1.2 Auslösung einer Aggregation 4
1.3 Hemmung von Thrombozyten 5
1.4 Regulation von Plättcheninhibierung und -aktivierung 7
1.5 ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten 8
1.5.1 P2X1 8
1.5.2 P2Y1 9
1.5.3 P2Yac/12 9
1.6 Pharmakologische Beeinflußbarkeit der Aktivierung von Thrombozyten 9
1.7 Herleitung der Fragestellung/Zielsetzung 10
2. Materialien 12
2.1 Bakterien 12
2.1.1 Bakterienstämme 12
2.1.2 Medien und Agarplatten für Bakterien 12
2.1.3 Zusätze für Medien und Agarplatten 12
2.2 Kulturzellen für Transfektions-Experimente 12
2.2.1 COS-7–Zelllinie (ECACC 87021302) 12
2.2.2 Humane Astrocytoma Zellline 1321N1 (ECACC 86030402) 12
2.3 Vektoren und Plasmide 13
2.4 Oligonukleotid-Primer 13
2.5 Chemikalien und Lösungen 15
2.6 Enzyme 15
2.7 Größenstandards 16
2.8 Kits 16
2.9 Antikörper und Antiseren 17
2.10 Verbrauchsmaterialien 17
2.11 Geräte 18

3. Methoden 20
3.1 Studienaufbau / Probanden 20
3.1.1 Ticlopidin – Probanden - Studie (Studie PLA 095.097) 20
3.1.2 Clopidogrel – Probanden - Studie (Studie PLA 095.097) 20
3.2 Thrombozytenpräparation aus Vollblut 21
3.3 Thrombozyten-Aggregationsmessungen 21
3.4 Intrazelluläre Calciummessungen in Thrombozyten 22
3.4.1 Präparation von gewaschenen Thrombozyten 22
3.4.2 Prinzip der Calcium-Messungen 22
3.4.2.1 Messung der Calcium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern 23
3.4.2.2 Messung der Calcium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern
und zusätzlich des Calcium-Influxes 23
3.5 cAMP-Bestimmung in Thrombozyten 23
3.5.1 Extraktion von cAMP aus Thrombozyten 23
3.5.2 Bestimmung der cAMP-Konzentration durch Radioimmunoassay 24
3.6 Immunologischer Nachweis von Proteinen durch Western-Blot-Technik 24
3.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 24
3.6.2 Transfer auf Nitrocellulose-Filter 25
3.6.3 Anfärben der Proteine auf Nitrocellulose-Filtern 25
3.6.4 Absättigung unspezifischer Bindungsstellen 26
3.6.5 Inkubation mit spezifischen Antiseren 26
3.6.6 Nachweis der Proteine 26
3.6.6.1 Nachweis durch jodiertes Protein A bzw. jodierte Anti-Maus-
Antikörper 26
3.6.6.2 Nachweis durch Chemolumineszenz 27
3.6.7 Quantitative Auswertung der radioaktiven Immunomarkierung 27
3.7 Probenaufbereitung der Proteine für den Nachweis mittels Western-Blot-Technik
3.7.1 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von VASP-Proteinen
27
aus Thrombozyten 27
3.7.2 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von Proteinen
aus Zellkultur-Zellen 28
3.7.2.1 Direkter Protein-Nachweis aus Zellkultur-Zellen 28
3.7.2.2 Proteinnachweis nach Immunpräzipitation 28

3.8 Methoden Molekularbiologie 28
3.8.1 Zentrifugation 28
3.8.2 Präparation kleinerer Mengen Plasmid-DNA für Klonierungen und
Sequenzierungen 28
3.8.3 Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA für Transfektionen
3.8.4 DNA-Konzentrationsbestimmung durch Messung der optischen
29
Dichte (OD) 29
3.8.5 Horizontale Agarosegel-Elektrophorese zum Auftrennen von
DNA-Fragmenten 29
3.8.6 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel
Extraction Kit 29
3.8.7 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem QIAquick PCR Purification Kit 30
3.8.8 RNA-Isolierung aus humanen Thrombozyten mit TRIZOL 30
3.8.9 RNA-Isolierung aus Astrocytoma 1321 N1 Zellen mit TRIZOL
3.8.10 Reverse Transkription – cDNA-Herstellung mit Hilfe des ProSTAR
30
First-Strand RT-PCR Kit 30
3.8.11 Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Polymerase-Ketten-
Reaktion (PCR) 31
3.8.12 Verdau von PCR-Fragmenten oder Plasmid-DNA mit
Restriktionsendonukleasen 31
3.8.12.1 Präparative Spaltungen 31
3.8.12.2 Analytische Spaltungen 32
3.8.13 Ligation von DNA-Fragmenten 32
3.8.14 Transformation kompetenter E.coli Zellen 32
3.8.15 Verifizierung der Plasmide mit Insert 32
3.8.16 Plasmid-Sequenzierung 33
3.8.17 In-Vitro-Protein-Synthese mit dem TNT Quick Coupled Transcription /
Translation System 34
3.9 Methoden Zellkultur 34
3.9.1 Kulturbedingungen 34
3.9.2 COS-7 – Zellen (ECACC 87021302) 34
3.9.3 Humane Astrocytoma Zellline 1321N1 (ECACC 86030402) 34
3.9.4 Passagieren adhärenter Zellen 34
3.9.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen 35

3.9.6 Transiente Transfektion adhärenter Zellen 35
3.9.6.1 Transfektion mit Hilfe der Calcium-Phosphat-Methode 35
3.9.6.2 Transfektion mit FuGENE 6 und Lipofectamine 36
3.9.7 Durchflußzytometrie 36
3.9.8 Immunpräzipitation 37
3.9.9 Indirekte Immunfluoreszenz 37
3.10 Methoden Calcium-Einzelzell-Messungen 38
3.10.1 Zellpräparation 38
3.10.2 Messungen 39
4. Ergebnisse 40
4.1 Durchführung der Thienopyridinstudien 40
4.2 Ergebnisse der Aggregationsmessungen 42
4.2.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619 und Thrombin für die
ex vivo durchgeführten Aggregationsmessungen 42
4.2.2 ADP-induzierte Aggregation 42
4.2.2.1 Normaler Verlauf einer ADP-induzierten Aggregation 42
4.2.2.2 Verlauf einer ADP-induzierten Aggregation nach Einahme von
Ticlopidin oder Clopidogrel 43
4.2.2.3 Wirksamkeit von Ticlopidin und Clopidogrel 43
4.2.2.4 Zeitverlauf der Ticlopidin-Wirkung 44
4.2.3 Synergistische Effekte von ADP und Epinephrine 45
4.2.4 Thrombin- und U46610-induzierte Aggregation 45
4.3 Ergebnisse der intrazellulären Calciummessungen in Thrombozyten 46
4.3.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619 und Thrombin für
die ex vivo durchgeführten Calciummessungen 46
4.3.2 Normaler Verlauf einer ADP-induzierten Calcium-Freisetzung aus
intrazellulären Speichern von Thrombozyten 46
4.3.3 Normaler Verlauf einer ADP-induzierten Cacium-Freisetzung aus
intrazellulären Speichern von Thrombozyten und einem zusätzlichen
Einstrom von extrazellulärem Calcium 47
4.3.4 Verlauf der ADP-induzierten Calcium-Freisetzung aus intrazellulären
Speichern von Thrombozyten während der Einnahme von Ticlopidin
oder Clopidogrel 47

4.3.5 Verlauf der ADP-induzierten Calcium-Freisetzung aus intrazellulären
Speichern von Thrombozyten und einem zusätzlichen Einstrom von
extrazellulärem Calcium während der Einnahme von Ticlopidin oder
Clopidogrel 48
4.3.6 Thrombin- und U46610-induzierte Calcium-Antworten 48
4.4 Ergebnisse der cAMP-Bestimmungen in Thrombozyten 49
4.4.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, Epinephrine, PG-E1 und
U-46619 für die ex vivo durchgeführten cAMP-Messungen in
Thrombozyten 49
4.4.2 ADP-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten Adenylcyclase
4.4.2.1 Normales Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit ADP
49
und PG-E1 stimulierten Thrombozyten 49
4.4.2.2 Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit ADP und PG-E1
stimulierten Thrombozyten während der Einnahme von Ticlopidin
oder Clopidogrel 50
4.4.3 Epinephrin-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten Adenylcyclase
4.4.3.1 Normales Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit Epinephrin
50
und PG-E1 stimulierten Thrombozyten 50
4.4.3.2 Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit Epinephrin und
PG-E1 stimulierten Thrombozyten während der Einnahme von
Clopidogrel 51
4.5 Ergebnisse der Untersuchung der VASP Phosphorylierung in Thrombozyten
4.5.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619, PG-E1 und Epinephrin
52
für die ex vivo durchgeführten cAMP-Messungen in Thrombozyten
4.5.2 ADP-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten VASP-
52
Phosphorylierung 52
4.5.2.1 Normales Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo mit
ADP und PG-E1 stimulierten Thrombozyten 52
4.5.2.2 Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo mit ADP und
PG-E1 stimulierten Thrombozyten während der Einnahme von
Ticlopidin oder Clopidogrel 53

4.5.3 Epinephrin-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten VASP-
Phosphorylierung 54
4.5.3.1 Normales Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo
mit Epinephrin und PG-E1 stimulierten Thrombozyten 54
4.5.3.2 Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo mit Epinephrin
und PG-E1 stimulierten Thrombozyten während der Einnahme
von Clopidogrel 55
4.6 Konstruktion der in dieser Arbeit verwendeten Plasmide 56
4.6.1 Klonierung der cDNA von P2Y1 56
4.6.2 Klonierung der cDNA von P2X1 56
4.7 Klonierung der Expressionsvektoren für P2Y1 und P2X1 / Epitope-Tagging
der Rezeptoren 56
4.7.1 FLAG-getaggte und c-myc-getaggte Rezeptoren 57
4.7.1.1 pCMV-P2Y1-N-Flag 58
4.7.1.2 pCMV-P2Y1-C-Flag 58
4.7.1.3 pCMV-P2Y1-N-Flag/C-c-myc 58
4.7.1.4 pCMV-P2X1-N-Flag 59
4.7.1.5 pCMV-P2X1-C-Flag 59
4.7.1.6 pCMV-P2X1-N-Flag/C-c-myc 59
4.7.2 HA-tagging von P2Y1 59
4.7.2.1 pcDNA3-P2Y1-HA-N 60
4.7.2.2 pcDNA3-P2Y1-HA-C 61
4.7.3 VSV-tagging von P2Y1 61
4.7.3.1 pcDNA3-P2Y1-VSV-N 61
4.7.3.2 pcDNA3-P2Y1-VSV-C 61
4.7.4 Klonierung eines Expressionsvektors ohne Tags für P2Y1 (P2Y1-nat) 62
4.7.5 Zusammenfassung 63
4.8 TNT Quick Coupled Transcription / Translation System Expression der Konstrukte 63

4.9 Expression in zellulären Systemen 64
4.9.1 Transiente Expression 65
4.9.2 Immunologischer Nachweis durch Western-Blot-Technik 65
4.9.2.1 Versuch des Nachweis der Expression von P2Y1 mittels der
Western-Blot-Technik 65
4.9.2.2 Nachweis der Expression von P2X1 mittels der Western-Blot-
Technik 66
4.9.3 Nachweis der Expression mittels Immunfloureszenz 67
4.9.3.1 Nachweis von P2Y1 67
4.9.3.2 Nachweis von P2X1 69
4.9.4 Analyse mittels Durchflußzytometrie 69
4.9.5 Stabile Expression – Etablierung von Stabilen Zellinien 71
4.10 Pharmakologie der stabil exprimierten Rezeptoren P2Y1 und P2X1 in
Astrozytoma 1321N1 Zellen 74
4.10.1 Native, nicht transfezierte Astrozytoma 1321N1 Zelllinie 74
4.10.2 Astrozytoma 1321N1 Zelllinie mit stabil exprimierenden P2Y1-VSV-C –
Rezeptoren 75
4.10.3 Astrozytoma 1321N1 Zelllinie mit stabil exprimierenden P2Y1-nat –
Rezeptoren 78
4.10.4 Astrozytoma 1321N1 Zelllinie mit stabil exprimierenden P2X1-C-
Flag - Rezeptoren 79
4.10.5 Versuche zur Regulation des P2Y1-Rezeptors in Astrozytoma 1321N1
Zellen 81
4.10.5.1 Versuche zu einer möglichen Regulation des P2Y1
Rezeptors durch eine Aktivierung der cGMP-abhängigen
Proteinkinase 81
4.10.5.2 Versuche zu einer möglichen Regulation des P2Y1
Rezeptors durch eine Aktivierung der cAMP-abhängigen
Proteinkinase 83

5. Disskusion 85
5.1 Studiendesign 85
5.2 Aggregation als Parameter der Wirksamkeit 86
5.3 Beeinflussung des P2X1 87
5.4 Beeinflussung des P2Y1 88
5.5 Beeinflussung des P2Yac/12 88
5.6 Beeinflussung des Phosphorylierungsstatus von VASP 89
5.7 Zusammenfassung/Ausblick 89
5.8 Klonierung der Rezeptoren / Plasmidkonstruktion 92
5.9 Expression in Zellen 92
5.9.1Transiente Expression 93
5.9.2 Stabile Expression 95
5.10 Calcium-Einzel-Zell-Messungen 95
5.10.1 P2X1 95
5.10.2 P2Y1 96
5.10.3 Erste Versuche zur Regulation der Rezeptoren 97
6. Zusammenfassung 100
7. Abkürzungen und Maßeinheiten 101
8. Literatur 104
Danksagung
Lebenslauf

1. Einleitung
Thrombozyten sind mit 2-4 µm Durchmesser die kleinsten Zellen im Blutkreislauf. Der Normbereich
der Thrombozytenkonzentration im Blut des Menschen beträgt 150.000 – 300.000 Zellen pro µl.
Entstehungsort der Thrombozyten ist das Knochenmark, wo sie durch Abschnürungen des
Zytoplasmas der Megakaryozyten entstehen. Nach einer Lebenszeit von 7 bis 10 Tagen erfolgt der
Abbau in der Leber und in der Milz. Die besonderen Kennzeichen der Thrombozyten sind die
diskoide Form („Plättchen“) und das Fehlen eines Zellkerns. Die Aufgabe der Thrombozyten liegt
vorwiegend in der primären Blutstillung (Hämostase), die durch eine Vernetzung von
Thrombozyten, der sogenannten Thrombozytenaggregation, gekennzeichnet ist (47).
Im intakten Gefäßsystem zirkulieren die Thrombozyten frei im Blut. Bei einer Verletzung der
Gefäßinnenwand kommt es zu einer Freilegung von prothrombotischem Gewebe sowie zur
Freisetzung löslicher Plättchenagonisten, was zu einer Aktivierung und Adhäsion von
Thrombozyten an der Stelle der Verletzung führt. Die Folgen sind eine Formveränderung der Zellen
(„shape change“), die Sekretion von Plättchenaktivatoren aus den Granula und das Vernetzen von
Thrombozyten miteinander, die sogennante Aggregation. Dieser Prozeß wird als primäre
Hämostase bezeichnet, makroskopisch entsteht ein weißer Thrombus. Parallel dazu kommt es zu
einer Aktivierung der Gerinnungskaskade. Dadurch werden Fibrinfibrillen gebildet, die sich an den
Thrombus anlagern und diesen stabilisieren. Das Ergebnis dieser sogenannten sekundären
Hämostase ist ein durch Miteinlagerung von Erythrozyten entstandener roter Thrombus (47).
Durch die klassischen Risikofaktoren Bluthochdruck, Diabetes, Hypercholesterinämie sowie
Tabakkonsum kann es zur Ausbildung von Artherosklerose kommen. Die dadurch hervorgerufenen
Veränderungen der Gefäßinnenwand bringen die normalerweise streng regulierte Balance von
aktivierenden und hemmenden Einflüssen auf die im Blutfluß zirkulierenden Thrombozyten außer
Kontrolle: Aktivierende Einflüsse gewinnen die Oberhand, eine unkontrollierte
Thrombozytenaggregation kann die Folge sein.
Ähnlich dem physiologischen Vorgang der Aggregationseinleitung durch eine Freilegung von
prothrombotischen Gewebe nach einer akuten Verletzung können Thrombozyten auch auf
rupturierten atherosklerotischen Plaques und in Regionen veränderten Blutflusses aktiviert werden,
was zur Exazerbation der bestehenden Läsionen führt: Die Folge können Herzinfarkt, peripherer
Gefäßverschluß oder Schlaganfall sein (43). Diese Erkrankungen des Gefäßsystems stellen die
häufigste Todesursache in den industrialisierten Ländern der westlichen Welt dar.
Die Aktivierung von Thrombozyten muß daher ein exakt regulierter Vorgang sein: Unter
physiologischen Bedingungen ist er lebenswichtig zur Verhinderung eines größeren Blutverlustes,
unter pathophysiologischen Umständen kann er aber zur akuten Lebensbedrohung werden. Ziel
1

einer medikamentösen Therapie vaskulärer Erkrankungen ist es daher, die Plättchen dahingehend
zu beeinflussen, daß auf der einen Seite der akute Gefäßverschluß durch die Thrombozyten
verhindert wird, auf der anderen Seite aber eine suffiziente Blutungsstillung weiterhin erhalten
bleibt.
Die unterschiedlichen Signalwege der Aktivierung und Hemmung sind im Thrombozyten über eine
Reihe von gemeinsamen Schnittstellen miteinander vernetzt, so daß der Aktivierungszustand eines
Thrombozyten unter physiologischen Bedingungen immer die Summe dieser beiden
gegensätzlichen Mechanismen darstellt.
1.1 Aktivierung
Die Thrombozytenaktivierung umfaßt sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung verschiedener
biochemischer Signalwege. Thrombozyten werden durch Adhäsion an den von Willebrand Faktor
(vWF), Kollagen und andere Proteine der subendothelialen Matrix sowie durch lösliche Agonisten
wie Thrombin, Thromboxan A2 (TxA2) und Adenosin-5'-diphosphat (ADP) aktiviert. Diese
Aktivatoren vermitteln über eine Neuorganisation des Zytoskeletts eine Formveränderung, die
Ausschüttung intrazellulärer Speicherorganellen und die Aktivierung von Oberflächenrezeptoren. All
dies führt letztlich zur Aktivierung des Fibrinogenrezeptors, der durch Bindung von Fibrinogen eine
Quervernetzung mit weiteren Thrombozyten eingehen kann: Es kommt zur Ausbildung von
Thrombozytenaggregaten.
1.1.1 Aktivierung durch membranständige Proteine
Nach Mikroverletzungen an den Blutgefäßen kommt es durch eine Schädigung der Endothelzellen
zu einer Freilegung der subendothelialen Matrix. Dort befinden sich eine Reihe von
prothrombotischen Proteinen, wobei der von Willebrand Faktor (vWF) und Kollagen eine zentrale
Rolle spielen (128). Durch Andocken an ihre jeweilen Rezeptoren (die Glykoproteine (GP) Ib,V und
XI für vWF(16;86) beziehungsweise GP VI für Kollagen (99)) kommt es zu einem Abbremsen
(tethering) und schließlich zur Adhäsion der Thrombozyten an die beschädigte Stelle im Gefäß
(128). Diese Rezeptoren sind dann auch in der Lage, durch Signaltransduktion ins Zellinnere des
Thrombozyten (outside-in-signaling) verschiedene – noch nicht näher charakterisierte - Signalwege
zu aktivieren, die zu einer Neuorganisation des Zytoskeletts (shape change) und schließlich zur
Aktivierung von weiteren Oberflächenrezeptoren wie dem Fibrinogen-Rezeptor GP IIb/IIIa (inside
out signaling) führen (2;142;143).
2

1.1.2 Aktivierung durch lösliche Agonisten
Neben den membranständigen Aktivatoren spielen auch lösliche Plättchenaktivatoren eine wichtige
Rolle bei der Aktivierung der Thrombozyten (11;12;102). Die Herkunft dieser Agonisten wie
Thrombin, TxA2 und ADP kann auf zwei unterschiedliche Quellen zurückgeführt werden: auf die
Freisetzung aus den beschädigten Endothelzellen sowie die Freisetzung aus den bereits aktivierten
Thrombozyten.
Viele dieser Aktivatoren interagieren mit heptahelikalen Rezeptoren, die auf ihrer
zytoplasmatischen Seite an heterotrimere GTP-bindende Proteine (G-Proteine) gekoppelt sind
(Tabelle 1). Diese G-Proteine funktionieren als Vermittler, welche die Signale der aktivierten
Rezeptoren an intrazelluläre Signalkaskaden weitergeben.
Agonist Rezeptor G-Protein Effektor Effekt
Thrombin PAR-1
PAR-4
Gαq
Gα12/13
Gαi
Thromboxan A2 TPα Gαq
ADP P2Y1
P2Y12
Gα12/13
Gαq
Gαi
PLC
RhoA
AC
PLC
RhoA
PLC
AC
Adrenalin α2A Gαi AC cAMP↓
PKC, Kalzium↑
Rhokinase↑
cAMP↓
PKC, Kalzium↑
Rhokinase↑
PKC, Kalzium↑
cAMP↓
Serotonin 5-HT2A Gαq PLC PKC, Kalzium↑
Tab. 1: Aktivierende G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf humanen Thrombozyten. Abkürzungen: PLC:
Phospholipase C; AC: Adenylyl Cyclase; PKC: Proteinkinase C; PAR: protease activated receptor (47;102)
G-Proteine bestehen aus einer α-Untereinheit, die Guanin-Nukleotide bindet und hydrolisiert, sowie
einer β�- und einer γ-Untereinheit, die zusammen einen Komplex bilden. Im inaktiven Zustand bindet
die α-Untereinheit GDP. Die Aktivierung des Rezeptors führt dazu, daß GDP durch GTP ersetzt
wird, die α-Untereinheit eine Konformationsänderung erfährt und vom βγ-Komplex dissoziiert. Die
α-Untereinheit und der βγ-Komplex können nun Effektormoleküle regulieren. Durch die GTPase-
Aktivität der α-Untereinheit wird das gebundene GTP zu GDP hydrolisiert, die α-Untereinheit bindet
wieder an den βγ-Komplex und bringt so das G-Protein zurück in den inaktiven Basalzustand (102).
Die verschiedenen G-Proteine regulieren unterschiedliche Signalwege in den Thrombozyten
(Tabelle 1) (13;102).
3

Gq aktiviert die β�-Isoform der Phospholipase C (PLCβ), die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
(PIP2) in Inositol-1,4,5- trisphosphat (IP3) und 1,2-Diacylglycerin (DAG) spaltet.
IP3 induziert einen Anstieg des zytosolischen Ca 2+ -Spiegels durch Kalzium-Freisetzung aus
intrazellulären Speichern (119), wodurch zahlreiche Kalzium-abhängige Enzyme reguliert werden,
wie beispielsweise die Zyklooxigenase, die Thromboxan-Synthase oder die Kalzium-/Calmodulinabhängige
myosin light chain kinase (MLCK), die durch Phosphorylierung der leichten Ketten des
Myosins (MLC) eine Reorganisation des Zytoskeletts einleitet (31;98). Diese führt zur
Formveränderung (shape change) des Thrombozyten, welche zusammen mit einer Aktivierung von
G12 und G13, die über den Rho/Rho-Kinase-Weg die Myosinphosphatase hemmen und so Ca 2+ -
unabhängig die Phosphorylierung der leichten Ketten des Myosins verstärken, vermittelt wird (77).
DAG, das zweite Produkt der PLC-Reaktion, aktiviert die Proteinkinase C (PKC), die über
Phosphorylierung der Substrate Pleckstrin und myristoylated alanine-rich C kinase substrate
(MARCKS) zur Sekretion von intrazellulären Speicherorganellen (Granula) beiträgt (36;123;144).
Bei der Granulasekretion werden vasoaktive und prokoagulatorische Substanzen wie plateletderived
growth factor (PDGF), Kalzium, Gerinnungsfaktoren, ADP, Serotonin und Fibrinogen
freigesetzt. Über die thrombozyteneigenen Rezeptoren verstärken diese den Aktivierungsprozeß,
aktivieren damit auch benachbarte Thrombozyten und wirken zusätzlich auf die Endothelzellen.
Gi hemmt die Adenylylzyklase und reduziert so die intrazelluläre Konzentration des in
Thrombozyten aggregationshemmenden Signalmoleküls cAMP. Zudem sind es vermutlich die βγ-
Komplexe der Gi-Proteine, die über Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI-3-Kinase) an
der Aktivierung des Fibrinogenrezeptors beteiligt sind (28;167).
1.2 Auslösung einer Aggregation
Die Bindung von Fibrinogen an den Fibrinogenrezeptor GP IIb/IIIa ist von zentraler Bedeutung für
die Thrombozytenaggregation. Sie ist abhängig vom Aktivierungszustand des Integrins, das
während der Thrombozytenaktivierung durch Konformationsänderung und Bündelung mehrerer
Integrine (klustering) in eine aktivierte Form überführt wird. Die Signale, die zur Aktivierung des GP
IIb/IIIa führen, werden als inside-out signaling bezeichnet (141). Wichtige Bestandteile sind die
Aktinfilamentbildung und Umbildung des Zytoskeletts (7;17), im Detail sind sie jedoch noch nicht
geklärt.
Die Entstehung einer Aggregation ist das Zusammenspiel der Aktivierung verschiedener G-
Proteine:
Die Aktivierung der oben genannten Gq-gesteuerten Signalwege ist notwendig für die Aktivierung
des GP IIb/IIIa und die Thrombozytenaggregation (103). Dies konnte durch Untersuchungen an
sogenannten Knock-out Mäusen, denen das Gen für die Codierung von Gq fehlt, gezeigt werden.
4

Thrombozyten dieser Tiere aggregieren nicht nach Stimulation mit ADP, Thrombin oder
Thromboxan, da die PLC nicht aktiviert werden kann. Weitere Unterstützung für diese Beobachtung
kam durch Experimente mit Thrombozyten von Mäusen, denen das Gen für die Codierung des an
Gq-gekoppelten ADP-Rezeptors P2Y1 fehlt: Hier kann durch Zugabe von ADP keine Aggregation
mehr ausgelöst werden (38;83). Diese Ergebnisse konnten auch durch eine funktionelle Hemmung
des P2Y1 durch ein modifiziertes ADP Analogon auf humanen Thrombozyten erzielt werden
(64;65;76;129). In beiden Fällen kann aber durch zusätzliche Stimulation des Gq-gekoppelten
Serotonin-Rezeptors eine vollständige Aggregation wiederhergestellt werden herstellbar
(64;75;129).
Aber auch durch Hemmung oder Fehlen des P2Yac/12 Rezeptors (41)ist eine vollständige
Aggregation nach Stimulation mit ADP nicht möglich. Erst zusätzliche Stimulation mit Adrenalin,
das über den α2A Rezeptor ebenfalls ein Gi -Protein aktiviert, stellt die ADP induzierte Aggregation
wieder her (76).
Für eine vollständige und irreversible Aggregation ist demnach eine gleichzeitige Stimulation von
Gq- und von Gi -Proteinen essentiell. Die Gq-Aktivierung löst dabei in einem ersten Schritt eine
Formveränderung und eine vorübergehende (reversible) Aggregation aus, die dann in Gegenwart
einer Gi -Stimulierung aufrecht erhalten, verstärkt und vervollständigt wird (76). Alleinige Stimulation
des Gi -Proteins bewirkt keine Aggregation. Die Notwendigkeit der gemeinsamen Aktivierung zweier
Signalwege für eine vollständige Aggregation ist unabhängig vom Stimulus: Serotonin (Gq)
zusammen mit Adrenalin (Gi ) lösen ebenso eine irreversible Aggregation aus wie ADP oder
Thrombin alleine, die beide Rezeptoren für Gq und Gi auf Thrombozyten besitzen (76) (siehe
Tabelle 1).
Es ist nicht geklärt, wie die Stimulation von Gi -Protein zur Aktivierung von Thrombozyten beiträgt.
Die Erniedrigung von cAMP durch Inhibierung der Adenylyl Cyclase ist vermutlich nicht der
entscheidende Mechanismus, da eine direkte, rezeptorunabhängige Hemmung der Adenylyl
Cyclase durch Inhibitoren nicht die Gi -Protein Stimulation bei der Aggregation ersetzen kann
(30;113;134). Alternativ wird eine Rolle des βγ-Komplexes diskutiert, der die Phosphatidylinositol-3
(PI-3) Kinase aktiviert (28;167).
1.3 Hemmung
Aktivierung, Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten sind unter physiologischen Bedingungen
einer strengen Regulation unterworfen. Dafür sind vor allem die Endothelzellen zuständig, die die
Innenwand von Gefäßen auskleiden (140;155).
Intakte Endothelzellen sezernieren ständig die physiologischen Plättcheninhibitoren
Stickstoffmonoxid (NO) und Prostacyclin (PG-I2), wodurch eine Aktivierung der Thrombozyten
5

verhindert wird (140;164). Beide Substanzen heben die intrazellulären Konzentrationen der
zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP an: NO und NO-freisetzende Substanzen wie
Natriumnitroprussid (SNP) erhöhen über eine direkte Aktivierung der Guanylylzyklase die
thrombozytäre cGMP-Konzentration, während PG-I2 und andere Prostaglandine, z.B. das in der
vaskulären Therapie eingesetzte Prostaglandin E1 (PG-E1), zuerst an den Prostaglandinrezeptor
binden. Dieser wiederum aktiviert dann über die α-Untereinheit seines Gs-Proteins die
Adenylylzyklase, was dann zur Bildung von cAMP führt. Abgebaut werden cGMP und cAMP durch
Phosphodiesterasen, die von diesen wiederum in positiven oder negativen Feedback-Schleifen
gehemmt oder aktiviert werden (34;140).
Die zyklischen Nukleotide entfalten ihre antiaggregatorische Wirkung hauptsächlich über die cAMPund
cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cAMP-PK und cGMP-PK) (15;50;126;160). Diese Kinasen
phosphorylieren eine Reihe von Proteinen und vermitteln dadurch die Hemmung verschiedener
Plättchenfunktionen: Es kommt zur Inhibierung des Kalziumsignals, der Adhäsion, der
Fibrinogenbindung und der Aggregation.
Zahlreiche Substrate der cAMP-PK und der cGMP-PK in Thrombozyten wurden bereits identifiziert
(140), darunter das Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) (58;158).
VASP, ein Zytoskelett-assoziiertes Protein, ist das am besten charakterisierte Substrat beider
Kinasen (14;145). Es ist in fast allen Zelltypen exprimiert, lokalisiert dort vor allem in fokalen
Kontakten, an Streßfasern und den Zell-Zell-Kontakten (116). Zahlreiche Interaktionen von VASP
mit Zytoskelettproteinen wie Profilin, Zyxin, Vinculin und Aktin sowie dem Oberflächenprotein ActA
des humanpathogenen Bakteriums Listeria monocytogenes (20;115;117;118) sind beschrieben
worden. VASP besitzt drei Phosphorylierungsstellen – Serin-157, Serin-239 und Threonin-278 – ,
die mit verschiedenen Kinetiken von der cAMP-PK und cGMP-PK phosphoryliert werden (14;145).
Die Aktinpolymerisation und die Bündelung von Aktinfilamenten werden durch VASP verstärkt (6).
Zusammen mit anderen Faktoren ist es vermutlich an den Umbildungen des Zytoskeletts beteiligt,
die in Thrombozyten zur Aktivierung des Fibrinogenrezeptors führen. Interessanterweise liegt VASP
in Thrombozyten in sehr hoher Konzentration vor (33). Es konnte gezeigt werden, daß die
Phosphorylierung des Serin-157, die man aufgrund einer Verschiebung des apparenten
Molekulargewichts von VASP von 46 kDa nach 50 kDa in SDS-Polyacrylamidgelen detektieren
kann (59), in Thrombozyten eng mit der Hemmung des Fibrinogenrezeptors korreliert (70).
Darüberhinaus zeigen Versuche mit Thrombozyten von VASP-knock-out-Mäusen, daß deren durch
niedrige Konzentrationen zyklischer Nukleotide ausgelöste Hemmung der Aggregation gestört ist.
Außerdem reagieren diese Thrombozyten mit verkürzter Aggregationszeit nach Stimulation mit
Kollagen und mit verstärkter Aktivierung des Fibrinogenrezeptors und P-Selektin-Expression nach
Stimulation mit Thrombin (4;63). Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß die
6

Phosphorylierung von VASP zumindest einen Teil der hemmenden Effekte der zyklischen
Nukleotide auf die Aktivierung der Thrombozyten, insbesondere auch die Veränderungen im
Zytoskelett, die zu einer Aktivierung des GP IIb/IIIa führen, vermittelt. Diese Befunde werden durch
Beobachtungen in Endothelzellen gestützt: Die Phosphorylierung von VASP führt zu einer
verminderten Präsenz von VASP in den fokalen Kontakten, die mit einer Auflösung des
Aktinfilamentsystems einhergeht. Zudem zeigen nicht-phosphorylierbare Mutanten des Proteins
diesen Effekt nicht mehr (146). Diskutiert wird eine verstärkende Rolle von VASP auf die
Aktinpolymerisation, die durch Phosphorylierung vermindert werden könnte (61). Kürzlich konnte
eine Rolle von VASP in der Signalkaskade des G12/13-Proteins gezeigt werden (46).
Die genaue Rolle, die VASP und die Phosphorylierung von VASP bei der Reorganisation des
Zytoskeletts und der Integrinaktivierung spielt, ist jedoch noch unklar.
Zyklische Nukleotide vermitteln auch die Hemmung des intrazellulären Kalziumanstiegs (50;51).
Zum einen verhindert eine Hemmung des PLC-Signalweges die Freisetzung von Ca 2+ aus
intrazellulären Speichern. Dies geschieht wahrscheinlich einerseits durch eine Reduzierung des
Substrates (PIP2) der PLC (124), und andererseits auf der Rezeptor- oder G-Protein-Ebene. Der
Thromboxanrezeptor beispielsweise wird in HeLa-Zellen und in vitro von der cAMP-PK oder der
cGMP-PK phosphoryliert, und in Thrombozyten werden die mit dem Thromboxanrezeptor
assoziierte GTPase-Aktivität und die nachfolgende Kalziumfreisetzung durch cGMP oder cAMP
gehemmt (159;161). Zusätzlich wird die Kalziumfreisetzung durch Hemmung des IP3-Rezeptors,
der auch ein Substrat der cAMP-PK und cGMP-PK ist, gehemmt (19;35).
Neben einer Hemmung der Neuorganisation des Zytoskeletts, der Verhinderung einer Aktivierung
des Fibrinogenrezeptors und dem Blockieren des intrazellulären Kalziumanstiegs wird durch cAMP
und cGMP auch die Sekretion der intrazellulären Granula gehemmt (94). Die Mechanismen der
Granulasekretion sind im Detail noch nicht erforscht, jedoch sind sowohl ein hoher zytosolischer
Kalziumspiegel als auch die Aktivierung der PKC essentiell für die Degranulierung (78;144;165).
Durch die Hemmung der PLC werden beide Effekte gehemmt. Es ist aber wahrscheinlich, daß die
cAMP-PK und cGMP-PK noch an weiteren Punkten des sekretorischen Prozesses eingreifen,
besonders da Veränderungen des Zytoskeletts involviert sind.
1.4 Regulation von Plättcheninhibierung und -aktivierung
Überschneidungen in den Signalwegen der Plättcheninhibierung und –aktivierung können über
gemeinsame Zieleffektoren erfolgen oder über hemmende beziehungsweise aktivierende
Phosphorylierung von Proteinen der jeweiligen Signalkaskade. Ein Beispiel für die Überschneidung
an einem gemeinsamem Zieleffektor ist die Adenylylcyclase (AC): Plättchenaktivatoren wie ADP
oder Epinephrin inhibieren die AC (24;79) und treten damit in direkte Konkurrenz mit
7

Plättcheninhibitoren wie PG-I2 oder Adenosin, die die AC stimulieren (12). Die Phosphorylierung
von Proteinen stellt vermutlich den wichtigsten Schnittpunkt der Regulation der Plättchenaktivität
dar. Eine Reihe von cAK und cGK Substraten sind bisher identifiziert worden (85;140), doch hat die
Phosphorylierung der einzelnen Proteine unterschiedliche Auswirkung auf die Plättchenaktivität. So
kann die Zyklonukleotid vermittelte Phosphorylierung von Substraten die Plättchenaktivierung an
verschiedenen Stellen der Signalkaskade hemmen: Phosphorylierung der α-Untereinheit des G13-
Proteins inhibiert die Rho/Rho-Kinase Signalkaskade und damit die Umorganisation des
Zytoskeletts (91). Auch wird die Freisetzung von Kalzium aus den intrazellulären Speichern durch
die Phosphorylierung des IP3-Rezeptors vermindert (19;35). Zahlreiche Zytoskelett-assoziierte
Proteine wie ABP (actin binding protein) (21), Caldesmon (66) und VASP werden ebenfalls durch
Zyklonukleotid-abhängige Kinasen reguliert (14;63;70). Auf der anderen Seite kann
Phosphorylierung im Sinne eines selbstregulierenden Rückkopplungsmechanismus (negativer
feedback-Mechanismus) zu einer Schwächung der Zyklonukleotid-vermittelten Plättcheninhibierung
führen. In humanen Plättchen verstärkt die Phosphorylierung der Phosphodiesterase (PDE) 3 (88)
und der PDE 5 (151) den Abbau von cAMP bzw. cGMP. Weitere Substrate der cAK und cGK sind
in anderen Zelltypen nachgewiesen worden, jedoch wurde eine Relevanz für Thrombozyten bisher
nicht belegt (140).
1.5 ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten
1.5.1 P2X1
Der P2X1-Rezeptor wurde erstmal 1994 beschrieben (153). Er ist ein ligandengesteuerter
Kationenkanal, der zum sofortigen Einstrom von Kalzium aus dem Extrazellulärraum führt. Die
genomische Sequenz ist beim Menschen auf Chromosom 17 lokalisiert (154). Der P2X1 besteht
aus 399 Aminosäuren mit zwei Transmenbran-Domänen, intrazelullärem amino- und
carboxyterminalem Ende sowie einer großen extrazellulären Schleife (114). Um eine Pore zu
bilden, müssen sich mindestens 3 P2X1-Untereinheiten zusammenlagern. Der P2X1 ist weitläufig
exprimiert auf erregbaren Zellen wie Muskelzellen und Neuronen sowie Gliazellen.
Pharmakologisch zeigt der in Xenopus laevis-Oozyten heterolog exprimierte P2X1 eine
Aktivierbarkeit durch ATP sowie verschiedene ATP-Derivate, sowie eine schwächere Aktivierbarkeit
durch ADP. Zudem ist die hohe Selektivität für αβ-methylen-ATP zu erwähnen, die der P2X1
aufweist (153;154). Eine weitere Besonderheit ist seine im Vergleich zu anderen P2X-
Familienmitgleidern schnelle Desensitisierung nach 1-2 Sekunden (101).
Der P2X1-Rezeptor war erstmals mit Thrombozyten in Zusammenhang gebracht worden, als klar
wurde, daß ein ligandengesteuerter Kationen-Kanal einen Teil der ADP-Antwort, nämlich den
8

schnellen Kalzium-Einstrom, vermittelt. In der Tat konnte der P2X1 dann molekular und
pharmakologisch in Thrombozyten nachgewiesen werden (23;135;148;156).
1.5.2 P2Y1
Der P2Y1-Rezeptor wurde erstmals 1993 im Huhn beschrieben (162), die humane Sequenz wurde
1996 publiziert (5). Im Menschen ist die genomische Sequenz auf Chromosom 3 lokalisiert (5). Der
P2Y1 besteht aus 373 Aminosäureresten und hat die klassische Struktur eines 7-Transmembran-
Domänen, G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Intrazellulär koppelt er an Gq (29;136;137). Er wird
von einer Reihe von Geweben exprimiert, inklusive dem Herz, Blutgefäßen, glatten Muskelzellen,
Nervengewebe, Hoden, Prostata sowie den Ovarien (114). Pharmakologisch kann der P2Y1 durch
ADP und insbesondere selektiv durch die ADP-Derivate d-ADP und 1-Me-ADP aktivert werden, die
Aktivierung durch ATP wird kontrovers diskutiert (84;108). Der P2Y1-Rezeptor war erstmals mit
Thrombozyten in Zusammenhang gebracht worden, als klar wurde, daß ein Gq-gekoppelter
Rezeptor einen Teil der ADP-Antwort, nämlich die Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären
Speichern, vermittelt. Das pharmakologische Profil dieses Plättchenrezeptors entsprach am
ehesten dem des P2Y1, der molekulare Nachweis konnte kurz darauf geführt werden (29;84).
1.5.3 P2Yac/12
Der P2Yac/12-Rezeptor wurde erstmals im Jahre 2000 auf molekularer Ebene beschrieben (68). Im
Menschen ist die genomische Sequenz ebenfalls auf Chromosom 3 lokalisiert. Der P2Y12 besteht
aus 342 Aminosäureresten und hat ebenfalls die klassische Struktur eines 7-Transmembran-
Domänen, G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Intrazellulär koppelt er an Gi. Er wird nur auf
Thrombozyten und in einigen Subregionen des Gehirns exprimiert (68). Pharmakologisch kann der
P2Yac/12 ebenfalls durch ADP und insbesondere durch das ADP-Derivat 2-MeSADP aktivert
werden (95). Der P2Yac-Rezeptor war erstmals in Zusammenhang mit Thrombozyten postuliert
worden, als klar wurde, daß ein Gi-gekoppelter Rezeptor einen Teil der ADP-Antwort vermittelt. Das
pharmakologische Profil dieses Plättchenrezeptors war lange vor der molekularen Identifikation
bekannt und war die Grundlage der hier vorgestellten Arbeit.
1.6 Pharmakologische Beeinflußbarkeit der Aktivierung von Thrombozyten
Thrombozyten spielen eine Schlüsselrolle bei der Exazerbation von arteriosklerotischen Läsionen
(3;152). Aus klinischer Sicht sind somit Thrombozytenaggregationshemmer (TAH) ein
unersetzlicher Bestandteil der primär- und v.a. sekundärprophylaktischen Behandlung von
kardiovaskulären Risikopatienten.
9

Verschiedene Substanzen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen stehen zur Auswahl:
Azetylsalizylsäure (ASS) (z.B. Aspirin ® ), die durch die irreversible Hemmung der Zyklooxigenase
die TXA2 –Synthese in Plättchen hemmt, auch in Kombination mit retadiertem Dipyridamol
(Aggrenox ® ), einem PDE-Hemmer, GPIIb/IIIa-Rezeptorantagonisten, die den aktivierten Fibrinogen-
Rezeptor auf der Thrombozytenoberfläche blockieren (z.B. RheoPro ® ) sowie die Thienopyridine
Ticlopidin (Tiklyd ® ) und Clopidogrel (Plavix ® oder Iscover ® ), die die ADP-vermittelte Aggregation der
Plättchen hemmen.
Während für ASS seit längerem eine Risikosenkung für vaskuläre Ereignisse bei Risikopatienten
gut belegt ist (152), konnte erst kurz vor Beginn dieser Arbeit in einer groß angelegten Studie die -
klinisch sogar signifikant dem ASS überlegene – Wirksamkeit von Clopidogrel gezeigt werden (18).
Trotz dieses Erfolges war zu diesem Zeitpunkt der exakte biochemische Wirkmechanismus der
Thienopyridine noch größtenteils unklar.
Ursprünglich als Entzündungshemmer entwickelt, wurde die Thrombozyten-hemmende Wirkung
der Thienopyridinderivate erst später entdeckt (150). Das Ticlopidin wurde in klinischen Studien
schließlich als Thrombozytenaggregationshemmer etabliert (92). Problematisch waren neben
leichteren gastrointestinalen Nebenwirkungen v.a. schwerwiegende hämatologische
Nebenwirkungen wie Leukozytopenie, Thrombozytopenie und Agranulozytose, die regelmäßige
Blutbildkontollen erforderlich machten (53;62) und Ticlopidin trotz guter Wirksamkeit (92) zu einem
Mittel zweiter Wahl machten.
Die Weiterentwicklung der Thienopyridine führte zum Nachfolger des Ticlopidins, dem Clopidogrel.
Clopidogrel ist eine racemische Verbindung, bei der das S-Isomer das pharmakologisch aktive
Stereoisomer ist. Clopidogrel ist wirkstärker als der Vorgänger (25), muß aber wie Ticlopidin auch
als sogenanntes Prodrug erst in der Leber in den aktiven Metaboliten verstoffwechselt werden
(131). Dies erfolgt wahrscheinlich über das Cytochrom P-450-1A (130). Die Verbindung zeigt die
schweren hämatologischen Nebenwirkungen des Ticlopidins nicht und ist im Allgemeinen gut
verträglich (138). Die Wirksamkeit von Clopidogrel wurde in der CAPRIE Studie, an der mehr als
19.000 Patienten teilnahmen, untersucht (18). Es zeigte sich, daß die Behandlung mit 75 mg
Clopidogrel das Risiko eines kardiovaskulären Ereignisses im Vergleich zur Standardtherapie mit
325 mg ASS signifikant verminderte. Clopidogrel wird in der Prävention ischämischer Ereignisse bei
Patienten mit arteriosklerotisch bedingten Gefäßerkrankungen und akut bei operativen Eingriffen an
Peripher- oder Koronararterien (stenting) eingesetzt (25).
1.7 Herleitung der Fragestellung
Zum Zeitpunkt des Beginns dieser Arbeit Mitte des Jahres 1996 wurde erstmals ein Modell
postuliert, nach dem drei verschiedene Rezeptoren die ADP-Antwort des humanen Thrombozyten
10

vermitteln: Die bereits molekular identifzierten P2Y1 und P2X1, sowie der zu diesem Zeitpunkt
lediglich pharmakologisch identifizierte P2Yac (29;49;75;129).
Zwar war bereits vom Ticlopidin bekannt, daß es die ADP-vermittelte cAMP-Spiegel-Senkung in
Plättchen aufheben kann (32;45). Für Clopidogrel existierten jedoch keine Daten für humanen
Thrombozyten. Ziel der Arbeit war es daher, den Wirkmechanismus des Clopidogrel an humanen
Thrombozyten in Hinblick auf das neue 3-Rezeptoren-Modell näher zu charakterisieren, auch im
Hinblick auf eine mögliche Beeinflussung intrazellulärer Signalwege. Hier sollten die Auswirkungen
einer Clopidogrel-Einnahme auf den Phosphorylierungsstatus des Proteins VASP untersucht
werden, da dies eine entscheidende Rolle bei der Hemmung der Aktivierung der Thrombozyten
spielen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die zum damaligen Zeitpunkt bereits molekular
beschriebenen ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2X1 untersucht. Ziel war eine Klonierung dieser
Rezeptoren aus Thrombozyten und Herstellung von Zelllinien, die diese Rezeptoren exprimieren,
um eine bessere pharmakologische und biochemische Charakterisierung zu ermöglichen.
11

2. MATERIALIEN
2.1 Bakterien
2.1.1 Bakterienstämme
E. coli (Epicurian Coli XL1-Blue Competent Cells, Stratagene)
E. coli (Epicurian Coli XL1-Blue MRF’ Kan supercompetent cells, Stratagene)
2.1.2 Medien und Agarplatten für Bakterien
Trypton (Bacto Tryptone, DIFCO)
Hefe-Extrakt (Bacto Yeast Extract, DIFCO)
LB-Medium: 2x YT-Medium:
1 % (w/v) Trypton 1,6 % (w/v) Trypton
0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt 1 % (w/v) Hefe-Extrakt
1 % (w/v) NaCl 0,5% (w/v) NaCl
in dH20 in dH20
Zum Gießen von Agarplatten werden 1,5% (w/v) Agar zugesetzt.
2.1.3 Zusätze für Medien und Agarplatten
100-200 µg/ml Ampicillin (Endkonzentration)
25-50 µg/ml Kanamycin (Endkonzentration)
40 µg/ml X-Gal (Endkonzentration)
1 mM IPTG (Endkonzentration)
2.2 Kulturzellen für Transfektions-Experimente
2.2.1 COS-7–Zelllinie (ECACC 87021302)
Die COS-7-Linie ist eine fibroblastenartige Zelllinie aus der Niere des Afrikanischen Grünen Affens,
die mit dem Virus SV40 transformiert wurde.
2.2.2 Humane Astrocytoma Zellline 1321N1 (ECACC 86030402)
Diese Zelllinie wurde aus humanen Astrozytoma-Zellen gewonnen (42;87).
12

2.3 Vektoren und Plasmide
Vektor Resistenz Bezugsquelle Verwendungszweck
pPCR-Script SK(+) Amp r Stratagene (PCR-
Script Amp Cloning
Kit)
Klonierung
pCMV-Tag1 Kan r Stratagene eukaryote Expression
pcDNA3 Amp r Invitrogen eukaryote Expression
Die im Laufe dieser Arbeit hergestellten Plasmide sind in Tabelle 4 (4.7.5) beschrieben.
2.4 Oligonukleotid-Primer
Die Oligonukleotide wurden bei Life Technologies oder bei Amersham Pharmacia Biotech in
Auftrag gegeben. Die Lagerung erfolgt in einer Konzentration von 1 µg/µl in dH20 bei –20 C.
Die 5’- Primer für die Herstellung der eukaryoten Expressionkonstrukte beinhalten zusätzlich
Sequenzen nach Kozak (80) für die Optimierung der Expression.
13

Bezeichnung Sequenz Schnittstelle Tag
GIK 88 5’-CGCCGCCTCCTACCCCTCGGAGCCG-3’ - -
GIK 89 5’-CCTACCATATTACAACAGAGAGGTG-3’ - -
GIK 96 5’-CCGTGTACATGTTCAATTTGGCTC-3’ - -
GIK 97 5’-CTCTTCTACTCAGGTACCGGGGTC-3’ - -
GIK 98 5’-CGGCTTGATTTTCAGACCCCAGC-3’ - -
GIK 99 5’-CACCCGGCTCACCCTGAGAGCAGAGGCCG-3’ - -
GIK 100 5’-GGCTCCAGGCTGAAGCCTCACGCTGTACC-3’ - -
GIK 101 5’-CGTGATCATGACCGAGGTGCTGTGGCCGGC-3’ Bcl I -
GIK 102 5’-GCTGATCAGGCTTGTATCTCCATTCTGC-3’ Bcl I -
GIK 103 5’-CGGATCCACCATGACCGAGGTGCTGTGGCC-3’ BamH I -
GIK 110 5’-GATCCAGCTGTGGGTCCTGG-3’ - -
GIK 111 5’-CTACTGCGCAGAGCACCCAG-3’ - -
GIK 112 5’-TCCACGCTTCAAGGTCAAC-3’ - -
GIK 113 5’-GTTCCATGGGCTGTACGAAG-3’ - -
GIK 114 5’-CATCCTGCCTAAGAGGCAC-3 - -
GIK 140 5’-GCGGATCCAGGCTTGTATCTCCATTCTGC-3 BamH I -
GIK 141 5’-GCGTCGACCAGGCTTGTATCTCCATTCTG-3’ Sal I -
GIK 142 5’-CGCGTGATCATGGCACGGCGGTTCCAGGAG-3’ Bcl I -
GIK 143 5’-GCTGATCAGGATGTCCTCATGTTCTCCTG-3’ Bcl I -
GIK 144 5’-CGCGGATCCACCATGGCACGGCGGTTCCAGG BamH I -
AG-3’
GIK 145 5’-GCGTCGACGGATGTCCTCATGTTCTCCTG-3’ Sal I -
GIK 148 5’-GCGGATCCGGATGTCCTCATGTTCTCCTG-3’ BamH I -
GIK 154 5’-GCGGATCCGCGCCACCATGACCGAGGTGCT
GTGGCCGGCT-3’
GIK 155 5’-CGCTCGAGCGTCACAGGCTTGTATCTCCATTC
TG-3’
GIK 156 5’-GCGGATCCGCGCCACCATGTACACTGATATCGA
AATGAACCGCCTGGGTAAGATGACCGAGGTGCTGTG
GCCGGCTGTCCCC-3’
GIK 157 5’-CGCTCGAGCTCACTTACCCAGGCGGTTCATTTC
GATATCAGTGTACAGGCTTGTATCTCCATTCTGCTTGA
ACTCAGG-3’
GIK 158 5’-GCGGATCCGCCACCATGTACCCATACGACGTG
CCAGACTACGCGATGACCGAGGTGCTGTGGCCG-3’
GIK 159 5’-CGCTCGAGCTCACGCGTAGTCTGGCACGTCGT
ATGGGTACAGGCTTGTATCTCCATTCTGCTTGAA-3’
BamH I -
Xho I -
BamH I VSV
Xho I VSV
BamH I HA
Xho I HA
GIK 160 5’-TGCTGTGGCCGGCTGTCCCCAACGGGACGG-3’ - -
GIK 161 5-CTCAGGTAAAATATTGAGGGTCATGTC-3’ - -
Tab. 2: Verwendete Oligonukleotid-Primers: Schnittstellen für Restriktionsenzyme in Fettdruck,
TAG-Sequenzen unterstrichen.
Weiterhin wurden für Sequenzierungen je nach Plasmid die Standardprimer M13 universal, M13
reverse, T7 und SP6 benutzt.
14

2.5 Chemikalien und Lösungen
Adrenalin (Suprarenin®, Hoechst/Aventis)
Formaldehyd, 10% (Polysciences)
PBS Dulbecco’s, ohne Kalzium, ohne Natriumbicarbonat (Life Technologies)
8-pCPT-cGMP (Biolog)
Trizol (Life Technologies)
ECL TM Western blotting analysis system (Amersham Pharmacia Biotech)
Acrylamid 4K-Lösung, 30%, 37,5 : 1 (AppliChem)
Agarose (NA, Amersham Pharmacia Biotech)
Tween 20 (SERVA)
Ethanol (Baker)
Chloroform (Baker)
EDTA (Baker)
Essigsäure (100%, Merck)
Methanol (Baker)
Phosphatidylethanol (Biomol)
Tris (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Merck)
Szintillationscocktail (Lumasafe Plus, Canberra-Packard Biosciences, Dreieich)
Complete TM EDTA-frei (Roche Diagnostics)
Zellkultur-Medium (Dulbecco’s modified Eagle medium mit 4,5 g/l Glucose, Life Technologies)
Fetales Kälberserum (FCS, Life Technologies)
Trypsin/EDTA-Lösung (0,5 g/l Trypsin; 0,2 g/l EDTA, Life Technologies)
Silikonöl (Merck)
Geneticin G418 (Roche Diagnostics)
Methionin [ 35 S] (ICN Pharmaceuticals)
Alle übrigen Reagenzien wurden im jeweils höchsten erhältlichen Reinheitsgrad von der Firma
Sigma bezogen.
2.6 Enzyme
Taq Polymerase (Perkin Elmer)
Pfu Polymerase (Stratagene)
Restriktionsenzyme (New England Biolabs, MBI Fermentas)
T4 DNA-Ligase (New England Biolabs)
15

2.7 Größenstandards
Agarosegelstandards (100 bp DNA Ladder plus und 1 kb Ladder, MBI Fermentas)
SDS-Polyacrylamidgelstandards (BenchMark Protein Standard, Life Technologies)
SDS-Polyacrylamidgelstandards gefärbt (New England BioLabs)
2.8 Kits
Kits zur Aufreinigung von Plasmid-DNA und RNA/DNA-Fragmenten (QIAGEN Plasmid Midi und
Maxi Kit, QIAprep Spin Plasmid-Kit, QIAquick PCR Purification Kit, QIAquick Gel Extraction Kit,
Rneasy Mini, QIAshredder, alle QIAGEN)
Gene Checker Kit (Invitrogen)
TNT Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega)
ProStar First-Strand RT-PCR Kit (Stratagene)
PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene)
Sequenzierkit (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Perkin Elmer)
ECL-Kit für Western Blot (Amersham Pharmacia Biotech)
Transfektionsreagenzen (FuGENE 6, Roche Diagnostics; Lipofectamine, Life Technologies)
16

2.9 Antikörper und Antiseren
Bezeichnung Antigen Markierung Spezies Bezugsquelle Verdünnung
M4 VASP Kaninchen
polyklonal
16C2
Phospho-
VASP-Ser239
P5D4 VSV
Glykoprotein
Anti-HA
(clone
12CA5)
Anti-FLAG
M2
Anti-c-myc
(clone 9E10)
Dynabeads
M-450
Schaf-anti-
Maus-Ig
G
Hämagglutinin
- Protein des
humanen
Influenza-
Virus
immunoGlobe 1:1500
Maus, IgG1� nanoTools 1:100
Maus, IgG1 Sigma 1:5000 (IF)
1:10000
Maus,
IgG2b
Roche
Diagnostics
(WB)
1:500 (WB)
1:1000 (IF)
FLAG-Peptid Maus, IgG1 Stratagene 1:500 (WB)
1:1000 (IF)
humanes cmyc-Protein
IgG1 Polysterol-
Beads
Maus IgG
Protein A Kaninchen
IgG
Ziege-anti-
Kaninchen-
HRP
Ziege-anti-
Maus-HRP
Kaninchen
IgG
Tab. 3: Antikörper und Antiseren
2.10 Verbrauchsmaterialien
Maus, IgG1 Roche
Diagnostics
Ratte DYNAL 1:20
1:40 (WB)
1:100 (IF)
125 I Schaf Amersham ca. 7,4
kBq/ml
125 I - ICN
Biochemicals
ca. 3,7
kBq/ml
HRP Ziege Amersham 1:3000
Maus IgG HRP Ziege BioRad 1:5000
Nitrocellulose für Western Blot (Protran NitrocelluloseTransfer Membrane Porengröße 0,45 µm,
Schleicher & Schuell)
Röntgenfilme (X-OMAT AR, Kodak)
Dialysekanüle venös 15G (Bionic Medizintechnik)
S-Monovette 5 ml (Sarstedt)
Polypropylenröhrchen 12 ml (Greiner)
Polypropylenröhrchen 50 ml (Greiner)
Eppendorf-Caps (1,5 ml und 2 ml, Eppendorf)
17

Quarzküvetten (Hellma)
Aggregationsröhrchen (7,25 x 55 mm, silikonisiert, Biodata)
Polypropylensäulen (leer, 1 ml, QIAGEN)
Sterilfilter (Ultra-Clear 5x41 mm, Beckman)
Kryoröhrchen (Nunc)
Gel Blotting Papier (Schleicher & Schuell)
S/W-Negativ Film (Tri-X PAN 400, Kodak)
Farb-Dia Film (Elitechrom 400, Kodak)
RIA Röhrchen (Polystyrol Röhrchen 12x75 mm, Greiner)
Szintillationsgefäß (6 ml Pony-Vials, Packard Liquid Scintillation Analyzer, Canberra-Packard
Bioscience)
Aggregationsröhrchen (Test Tubes, silikonisiert, 7,25x55mm, BIO/DATA)
2.11 Geräte
Zentrifugen (Sigma 3K-1, Eppendorf Centrifuge 5415 C und 5417 R, Hettich Roto Silenta/K)
Wasserbad (E12, Haake)
Thermomixer (Eppendorf Thermomixer 5436)
Heizblock (test tube heater stuart scientific, Heinse + Ziller)
Elektrophoresekammer für Polyacrylamidgele (Anfertigung Fa. Noras, Würzburg)
Elektrophoresekammer für Agarosegele (GNA-100, Amersham Pharmacia Biotech)
Feinwaagen (Analytic LC 4800 P und Analytic AC 120 S, Satorius)
Geltrockner (Drygel Sr. Modell SE 1160, Hofer Scientific intruments)
Spannungsgeber (Anfertigung Fa.H.Hölzl, München und Standard Power Pack P25 Biometra)
Blot-Kammer (Trans Blot Cell, BioRad)
Schüttler (Rocking Platform, Biometra)
Schüttler (DELFIA Plateshake 1296-003, PerkinElmer)
Schüttelinkubatoren (Certomat H bzw. BS-1, Braun Biotech International)
Entwickler (X-OMAT M 35, Kodak)
pH-Meter (PHM 92 LAB, Radiometer Kopenhagen)
Vortex Genie 2 TM (Bender & Hobein)
Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson)
Gamma-counter (LB 2104, Berthold)
Fluoreszenzspektrometer (Luminescence Spectrometer LS 50, PerkinElmer)
Mikroskop Zellkultur (Axiovert 25, Zeiss)
Fluoreszenzmikroskop (Aristoplan Epifluoreszenz-Mikroskop, Leitz)
18

PCR-Gerät (Gene Amp PCR System 2400, Perkin Elmer)
Photometer (Ultrospec 2000, Amersham Pharmacia Biotech)
ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer)
Szintillationszähler (Packard Liquid Scintillation Analyzer, Canberra-Packard Bioscience)
Brutschrank Bakterien (Haereus)
Brutschrank Zellkultur (Modell 3336, Labotect GmbH)
Kalzium-Einzel-Zell-Meßplatz:
Fluoreszenzmikroskop (Diaphot, Nikon)
Xenonlampe (Xenophot HLX, Osram)
CCD-Kamera (Theta-Systems)
Auswertungsprogramm (FUCAL, Till Photonics)
19

3. Methoden
3.1 Studienaufbau / Probanden
Die Studien wurden mit gesunden Probanden im Alter zwischen 23 und 48 Jahren durchgeführt, die
zu diesem Zeitpunkt keine Medikamente einnahmen, die die Thrombozytenfunktionen in
irgendeiner Weise beeinflussen konnten. Nach einer mündlichen Aufklärung über Studieninhalt,
mögliche Nebenwirkungen und Verhaltensweisen in einem solchen Falle unterzeichneten die
Probanden eine Einverständniserklärung und wurden über die Gerling Industrie GmbH versichert.
Da im Fall des Ticlopidin als ernste Nebenwirkungen Blutbildveränderungen auftreten können,
wurden bei beiden Studien bei jeder Blutabnahme auch das Blutbild kontrolliert.
Es wurden zwei Studien durchgeführt, eine mit Ticlopidin als Wirkstoff (Tiklyd ® ) und eine weitere mit
Clopidogrel (Plavix ® ), entsprechend den oben genannten Richtlinien.
Nach Vorliegen des positiven Votums der Würzburger Ethikkommission wurde die Studie dem
Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArm) vorgelegt und nachfolgend der
Regierung von Unterfranken angezeigt.
3.1.1 Ticlopidin – Probanden - Studie (Studie PLA 095.097)
4 Probanden (4 Männer zwischen 23 und 48 Jahren) nahmen 7 Tage lang zweimal täglich
(morgens und abends) je 250 mg Ticlopidin ein. Insgesamt wurden 8 Blutabnahmen durchgeführt,
und zwar:
1) unmittelbar vor der ersten Einnahme zur Bestimmung des Ausgangs-/ Kontrollwertes
2) 1 Tag nach Beginn der Einnahme
3) 3 Tage nach Beginn der Einnahme
4) 7 Tage nach Beginn der Einnahme
5) 3 Tage nach Absetzen
6) 7 Tage nach Absetzen
7) 11 Tage nach Absetzen
8) 18 Tage nach Absetzen
3.1.2 Clopidogrel – Probanden - Studie (Studie PLA 095.097)
6 Probanden (2 Frauen, 4 Männer; Alter zwischen 23 und 48 Jahren) nahmen 7 Tage lang einmal
täglich 75 mg Clopidogrel ein. Hier wurden 3 Blutabnahmen durchgeführt:
1) unmittelbar vor der ersten Einnahme zur Bestimmung des Kontrollwertes
2) 7 Tage nach Beginn der Einnahme
3) 4 Wochen nach Absetzen
20

3.2 Thrombozytenpräparation aus Vollblut
Thrombozyten werden aus frisch entnommenem, venösem Vollblut der Probanden isoliert. Für alle
Studien-Experimente außer den Kalzium-Messungen (dort gewaschene Thrombozyten; s. unten)
wurde Plättchen-Reiches-Plasma (platelet-rich-plasma oder PRP) verwendet.
Nach Punktion der Vena cubitalis mit einer Butterfly-Nadel der Größe 15 wird das Blut entnommen.
Die Koagulation der Blutes wird durch die Zugabe von CCD-Puffer im Verhältnis von 1:5 verhindert.
Die Zentrifugation für 20 Minuten bei 300x g bei Raumtemperatur führt zu einer Trennung des
Blutes in Erythrozyten, PRP und Leukozyten, die sich in der Grenzschicht zwischen Erythrozyten
und PRP befinden. Das PRP wird sorgfältig ohne Störung der benachbarten Schichten mit einer
Kunststoff-Pipette abgenommen. Zur Bestimmung der Thrombozytenzahl im PRP wird ein Aliquot
entnommen und mittels eines automatisierten Zählgerätes im Zentrallabor der Universitätsklinik die
genaue Anzahl ermittelt.
Alle Versuche mit Thrombozyten werden im Wasserbad bei 37°C und unter ausschließlichem
Einsatz von Kunststoffpipetten und –gefäßen durchgeführt.
Für die Stimulationsversuche werden die Plättchensuspension in Eppendorf Caps aliquotiert. Um
eine Präaktivierung der Plättchen durch die rauhe Innenwand der Caps zu vermeiden, werden
diese silikonisiert. Hierzu werden die Caps mit Sigmacote ® befüllt, nach drei Std. geleert, mit
demineralisierten Wasser gewaschen und bei 80°C für 30 Minuten ”gebacken”. Nach Abkühlen
können die Caps einmalig für einen Stimulationsversuch verwendet werden.
CCD-Puffer, pH 6,5:
Natriumzitrat 100 mM
Zitronensäure 7 mM
Glucose 140 mM
3.3 Thrombozyten-Aggregationsmessungen
Die Messung der Thrombozytenaggregation erfolgt in Anlehnung an die von Adams et al. (1985)
beschriebene Methode, wobei die Lichttransmission der Thrombozytensuspension indirekt
bestimmt wird.
Die Versuche werden in dem Thrombozytenaggregometer BIO/DATA Platelet Aggregation Profiler
Model PAP-4 durchgeführt. Das Meßprinzip beruht auf einer Messung der Transmission. Zunächst
wird eine thrombozytenarme Plasmaprobe (platelet-poor plasma, PPP) durch 2-minütige
Zentrifugation bei 5000g aus dem PRP des jeweiligen Probanden gewonnen. Das Aggregometer
wird mit diesem PPP, das dem Ergebnis einer maximalen Aggregation entspricht, auf 100%
Transmission geeicht. Demgegenüber streut PRP Licht entsprechend einer relativen Transmission
21

von 0%. Während der Messung wird das PRP durch einen Rührmagneten in der Küvette
kontinuierlich vermischt. Nach Zugabe eines Stimulans kommt es zur Aggregation und die
Thrombozytenaggregate sinken zu Boden, wodurch sich die optische Dichte der Probe verringert.
Es werden 300 µl PRP pro Messung eingesetzt, die im allgemeinen mit 3 µl des Stimulans versetzt
wurden. Die Proben werden bei 37°C in silikonierten Röhrchen inkubiert und mit ca. 900 rpm
gerührt.
3.4 Intrazelluläre Kalziummessungen
3.4.1 Präperation von gewaschenen Thrombozyten
Die Bestimmung der intrazellulären Kalzium-Konzentrationsänderungen in Thrombozyten erfolgt
nach der von Sage et al. (1990) (125) und Geiger et al. (1992) (50) beschriebenen Methode.
Für die Kalzium-Experimente werden die Thombozyten in einer speziellen Weise präpariert:
Zusätzlich zur Antikoagulation mit CCD-Puffer wird dem Vollblut Acetylsalicylsäure als 10 mM
Lösung (Endkonzentration 100 µM) zugegeben. Die PRP-Gewinnung erfolgt entsprechend dem
oben genannten Protokoll. Dann wird das PRP mit 0,1 U/ml Apyrase und dem Fluoreszenzfarbstoff
Fura-2 in Form seines Acetoxymethylesters als 0,4 mM Lösung in DMSO (Endkonzentration des
Farbstoffs 4 µM, 1 % (v/v) DMSO) versetzt und bei 37°C für 45 Minuten inkubiert. Nach einer
erneuten Zentrifugation (10 Minuten bei 420x g und Raumtemperatur) werden die Thrombozyten in
einer dem PRP entsprechenden Menge an Resuspensionspuffer resuspendiert. Die Thrombozyten
werden bis zur Versuchsdurchführung in kaltem Wasser aufbewahrt.
Resuspensionspuffer, pH 7,4:
NaCl 145 mM
KCl 5 mM
MgCl2 1 mM
HEPES 10 mM
Glukose 10 mM
3.4.2 Prinzip der Kalzium-Messungen
Das Absorptionsmaximum für freies Fura-2 liegt bei 362 nm, das entsprechende
Emissionsmaximum bei 518 nm, während der Fura-2-Kalzium-Komplex ein Absorptionsmaximum
bei 335 nm und eine maximale Emission bei 510 nm hat. Die Bestimmung der Fura-2-Fluoreszenz
wird im Luminescence Spectrometer LS 50 von PerkinElmer mit einer Anregungswellenlänge von
340 nm (Spaltweite 10 nm) und einer Registrierung der Emission bei 510 nm (Spaltweite 6-7 nm)
durchgeführt, so daß spezifisch die Fluoreszenz des Fura-2-Kalzium-Komplexes und damit des
22

freien Kalziums im Zytosol gemessen wird. Bei den Meßwerten handelt es sich um Daten der vom
Meßgerät vorgegebenen Größenordnung von 0 bis 1000. Sie erlauben keine direkten
Rückschlüsse auf die Absolutkonzentration an Kalzium in der Zelle, ermöglichen aber die exakte
Festellung von relativen Änderungen der intrazellulären Konzentration an Kalzium. Während des
Meßvorganges wird die Thrombozytensuspension (2,5 ml in einer Quarzküvette) durch einen
Magnetrührer gemischt und durch eine Wasserheizung bei einer konstanten Temperatur von 37°C
inkubiert.
Durch Veränderungen des extrazellulären Milieus kann eine reine Kalzium-Mobilisierung aus
intrazelluären Speichern von einem zusätzlichen Kalzium-Influx unterschieden werden.
3.4.2.1 Messung der Kalzium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern
Die Fluoreszenz-Messung erfolgt in Gegenwart von 1 mM EGTA, um eventuell vorhandenes
extrazelluläres Kalzium zu eliminieren und auf diese Weise einen möglichen Kalzium-Influx in die
Thrombozyten zu verhindern. Das gemessene Signal kann also komplett der intrazelluären
Mobilisierung von Kalzium aus Speichern gleichgesetzt werden.
3.4.2.2 Messung der Kalzium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern und zusätzlich des
Kalzium-Influxes
Hier erfolgt die Fluoreszenz-Messung in Gegenwart von 1 mM CaCl2 . Dadurch steht ausreichend
extrazelluläres Kalzium für einen möglichen Kalzium-Influx zur Verfügung, der sich von der
intrazellulären Kalzium-Mobilisierung durch eine spezifische Kinetik (schneller, steiler Anstieg,
rascher, ebenfalls steiler Abfall) unterscheidet.
Das gemessene Signal ist dann eine Kombination von Kalzium-Influx und Kalzium-Mobilisierung,
wobei der Influx an einem steileren und schnelleren Anstieg von dem daran angelagertem Signal
der Kalzium-Mobilisierung klar zu erkennen ist.
3.5 cAMP-Bestimmung in Thrombozyten
3.5.1 Extraktion von cAMP aus Thrombozyten
300 µl PRP werden mit der Stimulans versetzt und nach einem definierten Zeitpunkt mit 10000 rpm
in einer Eppendorf-Tischzentrifuge für 10 s abzentrifugiert. Der Überstand wird mittels einer
Wasserstrahlpumpe abgesaugt, das Thrombozyten-Pellet in 500 µl kaltem 70%igem Ethanol
resuspendiert und nach kurzem vortexen für 30 Minuten auf Eis gelagert. Dann werden die Proben
bei 4°C für 30 Minuten bei 14000 rpm zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorf-Cap
pipettiert. Anschließend werden nochmals 300 µl kaltes 70%iges Ethanol zugegeben, kurz
gevortext und wiederum 30 Minuten bei 4°C und 14000 rpm zentrifugiert. Erneut wird der
23

Überstand abgenommen und zum entsprechenden Überstand des vorherigen Durchgangs
pipettiert. Danach werden die Proben bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet und in 500 µl 50 mM
Natriumacetatpuffer aufgenommen.
3.5.2 Bestimmung der cAMP-Konzentration durch Radioimmunoassay
Die Bestimmung von cAMP erfolgt durch den Radioimmunoassay Biotrak für cAMP [ 125 J] von
Amersham Pharmacia Biotech.
Proben und Standards (jeweils zweimal zur Doppelbestimmung; Standards im Bereich von 25-1600
fmol/100µl) werden mit radioaktivem 125 Jod-cAMP versetzt, nach Zugabe von Anti-Succinyl-cAMP-
Kaninchenserum gemischt und für 3 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wird
Anti-Kaninchen-IgG-Serums zugegeben, kurz gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wird der Antigen-Antikörper-Komplex durch Zentrifugation für 10 Minuten
bei 1500x g pelletiert, der Überstand durch Dekantieren der RIA-Röhrchen abgegossen und die im
Pellet vorhandene Radioaktivität in einem Gamma-Zähler bestimmt. Die im Pellet nachweisbare
Radioaktivität verhält sich umgekehrt proportional zu der in der Probe vorhandenen nichtradioaktiven
cAMP-Menge. Anhand der Eichkurve der Standardwerte und der Thrombozytenzahl in
der Probe wird die cAMP-Konzentration bestimmt.
3.6 Immunologischer Nachweis von Proteinen durch Western-Blot-Technik
3.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgt durch diskontinuierliche SDS-
Polyacryamid-Gele (81). Bei diesem Gelsystem werden die Proteine zunächst in einem Sammelgel
konzentriert und daran anschließend im Trenngel entsprechend ihrer molekularen Masse
aufgetrennt.
Als Sammelgel dient ein 3%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel mit folgender Zusammensetzung:
2 Sammelgele (3% Acrylamid)
30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 1 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,7 1,25 ml
10%-ige SDS-Lösung 100 µl
TEMED 5 µl
dH2O 7,25 ml
APS 10% 400 µl
24

Als Trenngel wird in allen Fällen ein 9%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel mit der folgenden
Zusammensetzung verwendet:
2 Trenngele (9% Acrylamid):
30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 6 ml
3 M Tris-HCl pH 8,9 2,5 ml
10%-ige SDS-Lösung 200µl
TEMED 10 µl
dH2O 11,22 ml
APS 10% 200 µl
Es werden ausschließlich Gele von 1 mm Dicke verwendet. Die Elektrophorese wird mit einer
Maximalspannung von 100 Volt begonnen (Sammelgel), nach Übertritt der Proteine in das Trenngel
wird die Spannung auf maximal 150 Volt erhöht.
Elektrophoresepuffer, pH 8,9:
Tris 25 mM
Glycin 0,2 M
SDS 0,1%
3.6.2 Transfer auf Nitrocellulose-Filter
Nach Ende der Elektrophorese wird ein Nitrocellulose-Filter auf das Trenngel gelegt, beide
zusammen luftblasenfrei zwischen Whatman-Filterpapier und Kunststoff-Vliese in Plastikgitter
geklemmt und in eine mit auf 4°C vorgekühltem Transferpuffer gefüllte Blotkammer gegeben. Der
Transfer der Proteine von dem Gel auf die Nitrocellulose erfolgt durch eine senkrecht zu dem Gel
angelegte Spannung von 60-80 V für 60 Minuten bei 4°C.
Transferpuffer, pH 10,0:
Tris 25 mM
Glycin 192 mM
Methanol 20%
3.6.3 Anfärben der Proteine auf Nitrocellulose-Filtern
Zur Kontrolle der Transfereffizienz und zur Markierung der Positionen der Molekulargewichts-
Standards werden die Nitrocellulose-Filter nach erfolgtem Transfer mit 0.1% (w/v) Ponceau S in 5%
25

(v/v) Essigsäure kurz angefärbt und der Hintergrund durch Schwenken in deionisiertem Wasser
entfärbt. Nach erfolgter Dokumentation mittels Fotokopie werden die Proteine in PBS vollständig
entfärbt.
Ponceau-S Lösung:
0,1% Ponceau-S in 5% Essigsäure
PBS, pH 7,4:
NaH2PO4 pH 7,4 10 mM
Na2HP04, pH 7,4 10 mM
NaCl 150 mM
3.6.4 Absättigung unspezifischer Bindungsstellen
Die unspezifischen Bindungsstellen werden durch Inkubation der Nitrocellulose in Blockmedium für
mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur abgesättigt.
Blockmedium:
1% Rinder-Hämoglobin in PBS-TT
PBS-TT:
0,05% Tween und 0,3% Triton X 100 in PBS (s.o.)
3.6.5 Inkubation mit spezifischen Antiseren
Die geblockten Nitrocellulosen werden mit in Blockmedium verdünnten Antiseren (Konzentrationen
siehe Tabelle 3) für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schwenken inkubiert.
Daran anschließend werden die Nitrocellulose-Filter fünfmal mit PBS-TT für jeweils 5 Minuten
gewaschen.
3.6.6 Nachweis der Proteine
3.6.6.1 Nachweis durch jodiertes Protein A bzw. jodierte Anti-Maus-Antikörper
Der Nachweis von polyklonalen Anti-VASP-Antikörper M4 erfolgt durch 125 Jod-Protein A (3,7 kBq/ml
Blockmedium), der von monoklonalem Anti-Phospho-VASP-Antikörper 16C2 durch 125 Jod-Schafanti-Maus-Antikörper
(7,4 kBq/ml Blockmedium). Dazu werden die Nitrocellulosen mit den in
Blockmedium verdünnten 125 Jod-markierten Proteinen für 60 Minuten bei Raumtemperatur
26

inkubiert, anschließend fünfmal je 5-10 Minuten mit PBS-TT gewaschen und gebundene Aktivität
durch Autoradiographie nachgewiesen.
3.6.6.2 Nachweis durch Chemolumineszenz
Bei allen anderen Antikörpern als den oben beschriebenen erfolgt der Nachweis des gebundenen
Primärantikörpers durch eine Chemilumineszenz-Reaktion. Dabei wird die Lumineszenz, die bei der
Peroxidase-katalysierten Oxidation eines zyklischen Diacylhydrazids (Luminol) durch H2O2 entsteht,
zum Nachweis des an Meerettich-Peroxidase gekoppelten Sekundärantikörpers genutzt. Nach
einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur mit dem in Blockmedium verdünnten
Sekundärantikörper (1:1500 für Anti-Kaninchen-AK, 1:2500 für Anti-Maus-AK) und fünfmaligem
Waschen in PBS-TT für je 5-10 Minuten wird die Nitrocellulose für 1 Minute mit Detektionsmix
inkubiert, nach Abtropfen der Lösung in Overhead-Folie verpackt und sofort für einige Sekunden bis
zu wenigen Minuten auf einem Film exponiert.
3.6.7 Quantitative Auswertung der radioaktiven Immunomarkierung
Die radioaktiv markierten Proteinbanden werden mit einem Skalpell ausgeschnitten und die
gebundene Aktivität als radioaktive Zerfälle pro Minute (counts per minute (cpm)) in einem Gamma-
Zähler bestimmt. Da die gebundene Radioaktivität proportional zur Menge des auf der
Nitrocellulose vorhandenen und spezifisch markierten Proteins ist, erlaubt die Bestimmung der cpm
eine quantitative Auswertung der vorhandenen Proteinmenge.
3.7 Probenaufbereitung der Proteine für den Nachweis mittels Western-Blot-Technik
3.7.1 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von VASP-Proteinen aus
Thrombozyten
Nach Stimulation werden 300 µl PRP für 10 Sekunden bei 14000 rpm zentrifugiert, der Überstand
abgesaugt und das Pellet in 100 µl heißer 1x SDS-Lösung aufgenommen. Anschließend werden
die Proben für 10 Minuten bei 95°C gekocht. Gegebenenfalls werden die Proben danach bei –20°C
eingefroren.
Vor dem Auftragen auf das Acrylamidgel werden die Proben mit 3 µl ß-Mercaptoethanol versetzt
und für 5 Minuten bei 80°C erhitzt. Pro Geltasche werden zwischen 15 und 20 µg Gesamtprotein
aufgetragen.
27

3x SDS-Lösung:
Tris 200 mM
SDS 6%
Glycerin 15%
Bromphenolblau
ad 100 ml dH2O
0,003%
1x SDS-Lösung:
3x SDS 450 µl
ß-Mercaptoethanol 50 µl
dH2O 1 ml
3.7.2 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von Proteinen aus Zellkultur-Zellen
3.7.2.1 Direkter Protein-Nachweis aus Zellkultur-Zellen
Die Zellen werden in 6-Well-Patten ausgesät. Das Medium wird in einem Well abgesaugt und die
Zellen 2 mal mit PBS gewaschen. Dann wird 30-50 µl heiße 1x SDS-Lösung direkt auf die Zellen in
einem Well pipettiert, diese mit einem Zellspatel abgekratzt und ein Eppendorf-Cap überführt.
Fakultativ werden die Proben für 1-10 Minuten bei 95°C gekocht und dann bei –20°C eingefroren.
Vor dem Auftragen werden die Proben fakultativ für einige Minuten bei 80°C erhitzt. Pro Geltasche
werden zwischen 10 und 50 µg Gesamt-Protein aufgetragen.
3.7.2.2 Protein-Nachweis nach Immunpräzipitation
s. Methoden Immunpräzipitation 3.9.8
3.8 Methoden Molekularbiologie
3.8.1 Zentrifugation
Alle im folgenden nicht näher erläuterten Zentrifugationsschritte in Eppendorfgefäßen werden in
einer Zentrifuge vom Typ 5415C der Firma Eppendorf bei Raumtemperatur und 14000 rpm
ausgeführt.
3.8.2 Präparation kleinerer Mengen Plasmid-DNA für Klonierungen und Sequenzierungen
Kleinere Mengen an Plasmid-DNA (bis 50 µg) werden mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit
aufgereinigt. Die Präparation erfolgt nach Standardprotokoll. Nach Elution mit 50 µl dH2O wird die
Konzentration der Plasmid-DNA mittels OD-Messung (siehe 3.8.1.4) bestimmt und standardmäßig
auf 0.1 µg/µl eingestellt. Die DNA wird dann bei –20°C gelagert.
28

3.8.3. Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA für Transfektionen
Für die Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA wird der Pasmid-Midi Kit (QUIAGEN) (für DNA-
Mengen bis 100 µg) oder der Plasmid Maxi Kit (QUIAGEN) (bis 500 µg) verwendet. Die Präparation
erfolgt nach Standardprotokoll. Nach Bestimmung der Konzentration durch OD-Messung (siehe
3.8.1.4) wird die Plasmid-DNA standardmäßig auf 1 µg/µl eingestellt und bei –20°C gelagert.
3.8.4 DNA-Konzentrationsbestimmung durch Messung der optischen Dichte (OD)
Die Konzentration der Nukleinsäuren wird mit Hilfe der Bestimmung der optischen Dichte im
Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm errechnet. Dabei gelten folgende
Beziehungen: Die OD 260 von 1 entspricht einer Konzentration doppelsträngiger Nukleinsäuren
von 50 µg/µl und einer Konzentration einzelsträngiger Nukleinsäuren (z.B. Oligonukleotide oder
RNA) von 30 µg/µl.
3.8.5 Horizontale Agarosegel-Elektrophorese zum Auftrennen von DNA-Fragmenten
Für die analytische bzw. präparative Auftrennung von DNA-Molekülen wird eine horizontale
Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Je nach Größe der DNA-Moleküle wird dabei eine
Agarosekonzentration zwischen 1% und 1,5% verwendet. Zunächst wird die Agarose in 1x TAE-
Puffer durch Aufkochen gelöst. Nach Abkühlen wird Ethidiumbromid (0.5-1 µg/ml Endkonzentration)
zugesetzt und die Lösung luftblasenfrei in die horizontale, mit Kämmen bestückte Gelhalterung
gegossen. Als Laufpuffer dient 1x TAE. Die Elektrophorese erfolgt je nach Kammergröße bei 40-
150 V (3-6 V/cm). Die DNA-Moleküle im Agarosegel werden unter UV-Bestrahlung (λ=312 nm)
durch das in die DNA interkalierte, orange-fluoreszierende Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
50x TAE:
Tris 2,0 M
Eisessig 57,1 ml
Na-EDTA 50 mM
3.8.6 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel Extraction Kit
Zur Aufreinigung von durch Gelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
werden diese unter kurzfristiger UV-Licht-Kontrolle mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit dem
QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt (Standardprotokoll). Die Säulen werden mit 40 µl dH2O
eluiert und das Eluat bei –20°C gelagert.
29

3.8.7 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem QIAquick PCR Purification Kit
Nach PCR-Amplifikation erfolgt die Abtrennung des PCR-Produktes von den im Ansatz enthaltenen
dNTPs, Primern und der Polymerase mit dem QIAquick PCR Purification Kit nach
Standardprotokoll. Die Säule wird mit 30 µl dH2O eluiert. Um die Ausbeute zu erhöhen, wird die
Säule mit dem Wasser zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und/oder das Eluat erneut
geladen.
3.8.8 RNA-Isolierung aus humanen Thrombozyten mit TRIZOL
Mehrfach gewaschene und konzentrierte Thrombozytenpellets (ca. 50 µl), die aus
Thrombozytenkonzentraten der Transfusionsmedizinischen Abteilung der Universitätsklinik
Würzburg gewonnen wurden, werden mit 650 µl TRIZOL-Reagenz resuspendiert und mit Hilfe des
QIAshredders (QIAGEN) durch zweiminütige Zentrifugation homogenisiert. Nach Zugabe von
weiteren 800 µl der TRIZOL-Reagenz und 300 µl Chloroform wird das Gemisch mittels eines Vortex
so lange geschüttelt, bis eine einheitliche rosa Farbe zu sehen ist. Nach der anschließenden 15minütigen
Zentrifugation bei 4°C wird die oberste der drei entstandenen Phasen, welche die RNA
enthält, vorsichtig abgenommen und mit 700 µl Isopropanol präzipitiert (Zentrifugation für 15
Minuten bei 4°C). Nach Abnehmen des Überstandes wird das RNA-Pellet mit 80%igem Ethanol
gewaschen (Zentrifugation für 5 Minuten bei Raumtemperatur). Nach Entfernung des Alkohols wird
das Pellet 2-3 Minuten in der Speedvac angetrocknet und dann mit 20 µl eines Rnase-freien
Wassers aufgelöst (1-1,5 h bei 4°C). Anschließend wird die Konzentration der RNA mit Hilfe der
Bestimmung der OD (siehe 3.8.1.4) berechnet und die Qualität der RNA mit einer qualitativen
Agarosegel-Elektrophorese beurteilt. Die restliche RNA wird bei –80°C gelagert.
3.8.9 RNA-Isolierung aus Astrocytoma 1321 N1 Zellen mit TRIZOL
Für den Nachweis von P2Y1-mRNA aus Astrozytoma Zellen wird Gesamt-RNA aus den Zellen
eines Wells einer 6-Well-Platte nach Standardprotokoll gewonnen und mittels einer qualitativen
Gelelektrophorese beurteilt. Nach der OD-Bestimmung wird die RNA dann bei – 80°C gelagert.
3.8.10 Reverse Transkription – cDNA-Herstellung mit Hilfe des ProSTAR First-Strand RT-PCR
Kit
Die cDNA-Herstellung erfolgt nach Standardprotokoll. Es werden oligo(dT)-Primer und Random-
Hexamer Primer verwendet. Nach Beendigung der Reaktion wird die Qualität der cDNA mit Hilfe
des Gene Checker Kit überprüft, das Primer-Sets für die Amplifikation verschiedener Fragmente
von 5 hoch konservierten und ubiquitär exprimierten Genen enthält: GAPDH (ergibt 540 bp-
Fragment), 5’ Aktin (1 kb), 3’ Aktin (720 bp), 6K Clathrin (570 bp) und 2K Clathrin (550 bp). Jeder
30

cDNA-Ansatz wird nur bei erfolgreicher Amplifikation von mindestens zwei verschiedenen
Fragmenten weiterverwendet.
3.8.11 Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die genauen Reaktionsbedingungen der einzelnen Polymerasen können den
Gebrauchsanweisungen entnommen werden. Die 10x-Amplifikationspuffer werden vom jeweiligen
Hersteller mitgeliefert.
Der Reaktionsansatz enthält:
10x-Amplifikationspuffer der entsprechenden Polymerase 10 µl
dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Stammlösung: 2.5 mM) 200-250 µM
Oligonukleotid I 1 µM
Oligonukleotid II 1 µM
DNA-Template 50-100 ng
Taq-Polymerase oder Pfu-Polymerase
ad 100 µl dH2O
3,5 U
Im Thermocycler werden 20-30 Zyklen mit folgendem Standardprogramm durchlaufen:
Denaturierung: 94°C 1 Minute
Primer-Annealing: 50-60°C 1 Minute
Extension: 72°C 1-2 Minuten
Vor jeder Reaktion wird ein initialer Denaturierungsschritt von 3-5 Minuten bei 95°C und nach jeder
Reaktion ein finaler Syntheseschritt von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt.
Zur Ergebniskontrolle werden jeweils 10 µl des PCR-Ansatzes in einem Agarosegel analysiert.
Als DNA-Template werden entweder cDNA, PCR-Produkte oder Plasmid-DNA verwendet.
3.8.12 Verdau von PCR-Fragmenten oder Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen
10x - Enzympuffer und gegebenenfalls BSA werden vom Hersteller mitgeliefert.
3.8.12.1 Präparative Spaltungen
Für präparative Spaltungen von PCR-Produkten oder Plasmid-DNA wird ein Gesamtvolumen von
50 µl gewählt. Für den Verdau von ca. 4 µg DNA werden 20 U des jeweiligen Enzyms bei der
jeweils optimalen Temperatur (37°C, 50°C, 65°C) für zwei Stunden eingesetzt.
Um eine Religation der geschnittenen Plasmide zu verhindern, werden die Plasmide direkt im
Anschluß mit 1 µl Calf Intestinal Phosphatase (CIP) für eine Sunde bei 37°C versetzt. Dieser Schritt
31

ewirkt eine Dephosphorylierung der 5’-Enden und verhindert damit eine mögliche Religation des
Plasmids.
Nach Zugabe von 50 µl dH2O werden die Ansätze mit Hilfe des QIAquik PCR Purification Kit
aufgereinigt und mit 40 µl dH2O eluiert, was eine automatische Verdünnung auf ca. 0,1 µg/µl zur
Folge hat.
3.8.12.2 Analytische Spaltungen
Für analytische Spaltungen von Plasmid-DNA wird ein Gesamtreaktionsansatz von 20 µl für 300 ng
DNA gewählt. Normalerweise werden für den Verdau von 1 µg 5-10 U des betreffenden Enzyms
verwendet und der Ansatz bei der für das jeweilige Enzym optimalen Temperatur für mind. 1,5 h
inkubiert und dann auf einem Agarosegel analysiert.
3.8.13 Ligation von DNA-Fragmenten
Ligationspuffer (5-fach oder 10-fach konzentriert) wird vom Hersteller mitgeliefert.
Zur Ligation von DNA-Fragmenten (z.B. Insertion von Fragmenten in einen Vektor) werden
üblicherweise in einem Ligationsansatz von 20 µl zusammenpipettiert:
Vektor-DNA 50 ng
Insert-DNA in einem 5-20-fachen molarem Üeberschuß
T4 DNA-Ligase
Ligationspuffer
ad 20 µl dH2O
20-40 U
Der Ansatz wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
Für die Klonierung von DNA-Fragmenten, die durch eine PCR mit der Pfu-Polymerase (welche
“stumpfe Enden” produziert) entstehen, wird der Klonierungs-Vektor pPCR-Script Amp SK (+)
verwendet, der im PCR-Script Amp Cloning Kit enthalten ist (Standardprotokoll).
3.8.14 Transformation kompetenter E.coli Zellen
Die Transformation der Epicurian Coli XL 1-Blue MRF’ Kan supercompetent cells von
STRATAGENE erfolgte mit der Hitzeschock-Methode nach Standardprotokoll.
3.8.15 Verifizierung der Plasmide mit Insert
Da nicht alle Plasmide über eine “Blau/Weiß”-Selektionsmöglichkeit (ein aufgenommenes Insert
ruptiert das ursprünglich im Plasmid vorhandene Gen für die β-Lactamase, das in den Platten
enthaltetes β-Gal-Substrat in ein blaues Substrat metabolisieren kann: die Kolonien der Plasmide
32

mit Insert erscheinen weiß) verfügen und diese ohnehin nicht 100% zuverlässig ist, müssen die
Plasmide auf Insertion des Fragments überprüft werden. Dies erfolgt entweder über eine
analytische Spaltung der präparierten Plasmid-DNA (siehe 3.8.2.5.2) oder über eine PCR direkt aus
der Bakterien-Kultur für einen “Mini-Prep”.
Für die PCR wurde folgender Ansatz verwendet:
Übernacht-Kultur 1 µl
Primer I 1 µl
Primer II 1 µl
Q-Mix (QIAGEN)
ad 20 µl dH2O
10 µl
Das Programm kann auf 30 Zyklen (94°C 1 Minute, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute) beschränkt
werden.
Übernacht-Kulturen, die ein PCR-Produkt liefern, werden entsprechend 3.8.1.2 aufgearbeitet und
die Plasmid-DNA isoliert.
3.8.16 Plasmid-Sequenzierung
Zur genauerern Verifizierung der Klone werden diese sequenziert. Dabei wird folgende Reaktion
durchgeführt, beruhend auf der von Sanger et al 1977 beschriebenen Dideoxy-Methode (127):
Plasmid (= 5 µl bei 0.1 ug/µl für Doppelstrang-DNA) 500 ng
Sequenzier-Primer (T3, T7, SP6) (= 5 pmol aus 2.5 µm Stock-Lösung) 2 µl
Big Dye Terminator Ready Reaction Mix
ad 20 µl dH2O
8 µl
Programm:
96°C 10 Sekunden
50°C 5 Sekunden
60°C 4 Minuten
25 Zyklen, dann Abkühlung auf 4°C.
Anschließend wird die DNA mit 2 µl 3M Na-Acetat und 50 µl 100%igem Ethanol gefällt (30 Minuten
Zentrifugation bei 4°C) und mit 250 µl 80%igem Ethanol gewaschen (10 Minuten Zentrifugation bei
4°C). Nach vollständiger Entfernung des Ethanols wird das Pellet 2 Minuten in der Speedvac
33

angetrocknet und dann mit 12 µl des Template Supression-Kits bedeckt. Nach einer mind. 30
minütigen Lagerung bei 4°C werden die Proben auf den automatischen Sequenzierer ABI PRISM TM
310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) geladen.
3.8.17 In-Vitro-Protein-Synthese mit dem TNT Quick Coupled Transcription / Translation
System
Mit dem TNT Quick Coupled Transcription / Translation System ist es möglich, den Vorgang der
Translation und Transkription mit Hilfe eines Expressionsplasmids und eines Retikulozyten-Lysates
von Kaninchen in einem Eppendorf-Gefäß nachzuahmen.
Nach Zugabe der Plasmid-DNA und dem Zupippetieren der Kit-Reagenzien nach Standardprotokoll
wird 35 S-Methionin zugegeben und dann nach Beendigung der Reaktion das Produkt auf ein
Polyacrylamid-Gel (siehe 3.1.6.1) geladen. Nach der Gelelektrophorese (siehe 3.1.6.1) wird das
Gel mit einem Vakuum-Gel-Trockner getrocknet und dann die im Gel enthaltene Radioaktivität mit
Hilfe der Autoradiographie auf einem Film nachgewiesen (Standardprotokoll). Dabei dienen die
mitgelieferten Positivkontrollen als Größenstandard.
3.9 Methoden Zellkultur
3.9.1 Kulturbedingungen
Die Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
3.9.2 COS-7 – Zellen (ECACC 87021302)
Die COS-7-Linie ist eine fibroblastenartige Zelllinie aus der Niere des Afrikanischen Grünen Affens,
die mit dem Virus SV40 transformiert wurde.
Die Kultivierung erfolgt in DMEM mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin.
3.9.3 Humane Astrocytoma Zellline 1321N1 (ECACC 86030402)
Diese Zelllinie wurde aus humanen Astrozytom-Zellen gewonnen. Die Kultivierung erfolgt in DMEM
mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin.
3.9.4 Passagieren adhärenter Zellen
Zum Passagieren werden die adhärenten Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit einem
geringen Volumen Trypsin/EDTA bis zum Ablösen bei Raumtemperatur inkubiert. Die abgelösten
Zellen werden in Komplett-Medium resuspendiert und entsprechend der gewünschten Verdünnung
in eine mit Medium vorgefüllte neue Flasche pippettiert und im Brutschrank inkubiert. Für die
indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie und für die Kalzium-Einzelzell-Messungen werden die
34

Zellen auf sterilisierten Deckgläschen (Durchmesser 15 mm) in sogenannte ‘6-Well’-Platten
ausgesät, für Immunpräzipitationen in 6 cm-Schalen.
3.9.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zur langfristigen Lagerung adhärenter Kulturzellen werden diese eingefroren. Entsprechend obigem
Protokoll werden die Zellen abtrypsiniert, abzentrifugiert und anschließend in 1,5 ml Einfriermedium
aufgenommen. Dann werden die Zellen in Kryoröhrchen überführt und über Nacht bei –20°C
aufbewahrt, ehe sie zur endgültigen Lagerung in flüssigem Stickstoff plaziert werden.
Das Auftauen erfolgt im Wasserbad bei 37°C. Die Zellen werden in eine mit Medium befüllte
Kulturflasche überführt und anschließend für 12-24 Stunden im Brutschrank inkubiert, ehe das
DMSO und und die toten Zellen durch einen Mediumwechsel entfernt werden.
Einfriermedium: 90% FCS
10% DMSO
3.9.6 Transiente Transfektion adhärenter Zellen
3.9.6.1 Transfektion mit Hilfe der Kalzium-Phosphat-Methode
Diese Methode wird nur für die Transfektion von COS-7 – Zellen verwendet. Es werden nur Zellen
mit einer Konfluenz von 40-60% transfiziert.
Für die 3,5 cm Schälchen werden 10 µl der zu transfezierenden DNA (Konzentration: 1ug/ul) in
spezielle 15 ml Polypropylen-Röhrchen (Nunc 374640) vorgelegt und mit sterilem Millipore-Wasser
auf 67,5 µl verdünnt. Durch Antippen des Röhrchens wird die DNA-Lösung vorsichtig gemischt.
Dann werden 75 µl 2x-HEBS-Puffer zugegeben und wieder vorsichtig gemischt. Schließlich werden
7,5 µl 20x-CaCl2-Lösung in zwei Aliquots zugegeben und nach jeder Zugabe durch Antippen des
Röhrchens gemischt. Die Lösung wird zur Präzipitat-Bildung bei Raumtemperatur mindestens 45
Minuten inkubiert. Dann wird das Medium auf den Zellen auf 1,5 ml (Schale mit 3,5 cm
Durchmesser) reduziert, die Präzipitat-Lösung tropfenweise hineinpipettiert und das Schälchen zum
Verteilen des Präzipitats leicht geschwenkt. Die Zellen werden 3-5 Stunden im Brutschrank mit dem
Präzipitat inkubiert, bevor neues Medium zugegeben wird.
Die Ernte der Zellen erfolgt zwei Tage nach Beginn der Transfektion.
35

Lösungen:
2x-HEBS:
NaCl 280 mM
HEPES 50 mM
Na2HPO4 41,5 mM;
pH 7,1 (kritisch)
20x-CaCl2:
CaCl2
2,5 M
3.9.6.2 Transfektion mit FuGENE 6 und Lipofectamin
Für die Transfektion von COS-7 – Zellen wird zusätzlich Lipofectamin verwendet, für die 1321N1-
Zellen ausschließlich FuGENE 6. Die Transfektion mit diesen Reagenzien ist in der Regel bei
höherer Effizienz schonender für die Zellen. Zudem werden geringere Mengen an DNA benötigt.
Die Transfektion erfolgt jeweils nach Standardprotokoll. Bei der Transfektion mit FuGENE 6 ist vor
der Ernte der Zellen nach 2 Tagen wegen der geringen Toxizität der Transfektionsreagenz kein
Mediumwechsel nötig.
3.9.7 Durchflußzytometrie
Die Expression des N-getaggten Rezeptors P2Y1 auf der Oberfläche von COS-7 und Astrocytoma
Zellen wurde am Durchflußzytometer mit Hilfe eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers gegen den
Anti-VSV-Antikörper bestimmt.
Die Zellen eines Wells einer 6-Well-Platte werden mit 750 µl 0,5 mM EDTA abgelöst. Nach Zugabe
von 750 µl Mediums werden die Zellen in ein Eppendorf-Cap überführt und in einer Eppendorf-
Tischzentrifuge für 5 Minuten bei 1500 rpm zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wird das
Pellet vorsichtig in 100 µl PBS resuspendiert und die Zellen mit 1,4 ml Formaldeyd 4% für 10
Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach erneuter 5-minütiger Zentrifugation bei 1500 rpm wird
das Pellet in 500 µl PBS aufgenommen und mit dem anti-VSV-Antikörper P5D4 versetzt. Nach 30–
45 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen wieder 5 Minuten bei 1500 rpm
zentrifugiert. Das Pellet wird diesmal mit 300 µl PBS resuspendiert. Dann werden 7 µl des
fluoreszenz-markierten Antikörpers FITC-anti-mouse zugegeben und die Caps bei 4°C für 20
Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (5 Minuten bei 1500 rpm)
wird das Pellet in 300 µl PBS aufgenommen und durchflußzytometrisch am FACScalibur der Firma
Becton Dickinson vermessen. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm CellQuest
36

(Version 1.0, Becton Dickinson). In Form von Histogrammen wird die Fluoreszenzintensität gegen
die Anzahl der Zellen aufgetragen.
3.9.8 Immunpräzipitation
Die auf 6 cm-Schalen ausgesäten, konfluenten Zellen werden zweimal kurz mit PBS gewaschen
und dann 20 Minuten auf Eis mit 0.5 ml 1x MIPP-Lösung, die zusätzlich verschiedene
Proteaseinhibitoren in Form einer Tablette Complete TM EDTA-frei (1 Tablette/10 ml) enthält,
versetzt, um die Zellen zu lysieren. Nach Abkratzen der Zellen werden diese dreimal durch eine
25G-Kanüle aufgezogen, um die Zellsuspension zu homogenisieren. Anschließend werden die
Zelllysate bei 4°C 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig abgenommen und mit
dem entsprechenden Antikörper versetzt. Nach 2-3 stündiger Inkubation bei 4°C unter ständigem
Drehen werden als Zweiantikörper ‘Dynabeads’, die an magnetische Beads gekoppelte
monoklonale Ratten-Antikörper gegen Maus-Antikörper der Subklasse IgG1 darstellen, zugegeben
und erneut 2-3 Stunden bei 4°C unter Drehen inkubiert. Dann wird das Präzipitat mit Hilfe eines
Magneten pelletiert, der Überstand abgenommen und das Pellet mit 20 µl 3x SDS bei
Raumtemperatur abgestoppt (20 Minuten). Die Proben werden dann bei –20°C gelagert.
Vor dem Auftragen in die Gel-Taschen werden die Proben fakultativ für einige Minuten auf 80°C
erhitzt. Pro Geltasche werden die kompletten 20 µl aufgetragen.
2 x MIPP-Lösung:
Tris 40mM pH 7,4
NaCl 150 mM
Natrium-Deoxycholat 2%
Triton X-100 2%
SDS 0,2%
Natrium-Pyrophosphat 20 mM
EDTA 20 mM
Natrium-Orthovanadat 1 mM
p-Nitrophenylphosphat 10 mM
Natrium-Fluorid 100 mM
3.9.9 Indirekte Immunfloureszenz
Auf Deckgläschen (Durchmesser 15 mm) bis zu max. 80% Konfluenz gewachsene Zellen werden
zweimal kurz mit PBS gewaschen und dann mit 4% (w/v) Formaldehyd in PBS (pH 7,4) 15 Minuten
auf Eis fixiert. Nach erneutem zweimaligen Waschen mit PBS werden die Zellen fakultativ 10
37

Minuten mit 0.2% (v/v) Triton X-100 in PBS permeabilisiert und anschließend wieder zweimal mit
PBS gewaschen. Dann werden sie je 45 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer mit dem
jeweiligen Primär- und Sekundärantikörper inkubiert. Auch zwischen dem Inkubationsschritt und
nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper werden die Zellen jeweils zweimal mit PBS
gewaschen. Die Deckgläschen werden nach dem letzten Waschschritt kurz mit deionisiertem
Wasser gespült, um ein Auskristallisieren von Salz beim Trocknen zu verhindern. Das
überschüssige Wasser wird mit Papier vorsichtig abgetupft. Das Deckgläschen wird dann in einen
auf einem Objektträger aufgebrachten Tropfen Mowiol-Lösung eingebettet. Zum Aushärten der
Mowiol-Lösung wird das Präparat lichtgeschützt über Nacht bei 4°C aufbewahrt und dann auch
weiterhin im Dunkeln bei 4°C gelagert.
Mowiol-Lösung:
15 g Mowiol 4-88 werden unter Rühren (24h) in 60 ml PBS (pH 8.0) gelöst. Die Lösung wird mit 30
ml wasserfreien Glycerin und 2.5% (w/v) n-Propylgallat (Bleichschutz) versetzt. Nach Abtrennung
unlöslicher Bestandteile durch 15 minütige Zentrifugation bei 17300 g wird der Überstand in
Aliquots bei –20°C gelagert.
3.10 Kalzium-Messungen an Einzelzellen
3.10.1 Zellpräparation
Die Zellen werden auf Deckgläschen mit 15 mm Durchmesser in 6-Well-Platten ausgesät und bis
maximal 70% Konfluenz wachsen lassen. Nach Absaugen des Kulturmediums werden die Zellen
zweimal mit HBS:Ca gewaschen. Anschließend werden sie in HBS:Ca mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 in Form seines Acetoxymethylesters als 0,4 mM Lösung in DMSO
(Endkonzentration des Farbstoffs = 4 µM, 1 % (v/v) DMSO) versetzt und bei 37°C für 30 Minuten
inkubiert. Danach werden die Zellen erneut zweimal mit HBS:Ca gewaschen und dann in HBS:Ca
bei 37°C bis zur Messung aufbewahrt.
HBS:Ca:
NaCl 140 mM
KCl 5,4 mM
MgCl2·6H2O 0,5 mM
CaCl2·2H2O 1,5 mM
D-Glukose 10 mM
BSA 1 mg / ml
HEPES 15 mM
38

Anmerkung: Das HBS:Ca wurde erst am Versuchstag mit der entsprechenden Menge BSA versetzt
und danach der pH-Wert auf 7,40 eingestellt.
3.10.2 Messungen
Für die Einzelzellmessungen wird ein Nikon Diaphot Fluoreszenzmikroskop mit 10-fach und 40-fach
Fluoreszenzobjektiven benutzt. Das Anregungslicht wird von einer Xenon Lampe (Osram Xenophot
HLX) erzeugt. Das Objekt wird von unten beleuchtet und beobachtet. Das Objektbild wird mit einem
40-fach Fluoreszenzobjektiv auf das CCD-Element einer gekühlten CCD-Kamera fokussiert. In
vorgegebenen Zeitabständen wird das Kamerabild von der Steuerungseinheit ausgelesen, mit
einem 12-bit Analog/Digitalwandler digitalisiert und auf einem Rechner abgespeichert. Die
Datenerfassung und die Auswertung erfolgt mit dem Programm ‘FUCAL’ von ‘Till Photonics’. Die zu
beobachtenden Zellen befinden sich auf runden Deckgläschen (Durchmesser 15mm) in HBS:Ca.
Die Deckgläschen wiederum sind in einem Plastik-Schälchen mit einem Plexiglasrand (Eigenbau)
in eine Kunststoffhalterung eingespannt.
Die Messungen von Kalziumkonzentrationen werden mit Fura-2 AM entsprechend dem oben
erwähnten Prinzip (siehe 3.1.4.2) durchgeführt. Es werden Kamerabilder abwechselnd bei einer
Anregungswellenlänge von 340 nm und 380 nm aufgezeichnet. Nach der Messung wird von den
Bildern zunächst der Hintergrund, der zuvor bei einer Anregungswellenlänge von 280 nm
aufgenommen worden ist, abgezogen, dann aus jedem Bilderpaar der Quotient gebildet und vom
Rechner abgespeichert. Um den zeitlichen Verlauf der Veränderung der Kalziumkonzentrationen
sichtbar zu machen, muß für jede einzelne Zelle nun ein Bereich (region of interest= ROI) festgelegt
werden, dessen Fluoreszenzintensität für jedes Einzelbild gemittelt und gegen die Zeit aufgetragen
wird.
39

4. Ergebnisse
4.1 Durchführung der Studien
Es wurden zwei Studien durchgeführt (vgl. Methoden 3.1). Den Probanden wurden bei jeder
Blutabnahme 40 ml Vollblut entnommen, für die Kalzium-Messungen zusätzlich 40 ml. Die bei jeder
Blutabnahme durchgeführten Blutanalysen (sogenanntes ‘kleines’ Blutbild) ergaben für alle
Probanden in beiden Studien Normalwerte bei jeder Messung.
Das Design der Studien war identisch: Nach Präparation des PRP wurde ein Teil für
Aggregationsmessungen verwendet, ein anderer für Stimulationsversuche für Western-Blot-Proben
bzw. RIA-Proben und ein anderer Teil für die Gewinnung von gewaschenen und mit FURA-2
beladenen Thromboztyen, die für Kalzium-Messungen verwendet wurden.
Der einzige Unterschied zwischen den Studien neben den unterschiedlichen Substanzen war der
Zeitplan für die Blutabnahmen: Für die Ticlopidinstudie wurde insgesamt 8 mal Blut entnommen,
um einen Einblick in den Zeitverlauf der Wirkung der Substanz zu erhalten. Für die darauf folgende
Studie mit dem verwandten Wirkstoff Clopidogrel wurden die Blutabnahmen auf drei entscheidende
Termine festgelegt: vor, direkt nach Beendigung und 4 Wochen nach Einnahme des Wirkstoffes für
7 Tage.
40

Zeitplan:
CLOPIDOGREL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TICLOPIDIN
Blutproben entnommen
t [Tage]
Abb. 1: oberer Teil: schematische Darstellung des Studiendesigns für die Ticlopidin- und die
Clopidogrel-Studie;
unterer Teil: schematische Darstellung der für die beiden Studien unterschiedlichen Zeitpunkte der
Blutentnahme.
41

4.2 Ergebnisse der Aggregationsmessungen
4.2.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619 und Thrombin für die ex vivo
durchgeführten Aggregationsmessungen
Da die Konzentrationen der verschiedenen Substanzen, die zur Auslösung einer maximalen ex vivo
Aggregation benötigt werden, individuelle Unterschiede zeigten, wurden in Vorversuchen an
verschiedenen gesunden Probanden die Konzentrationen bestimmt, die mit größter
Wahrscheinlichkeit eine maximale Aggregation für alle Probanden auslösen. Diese Konzentrationen
betrugen 20 µM für ADP, 5 µM für U-46619 und 1 U/ml für Thrombin. Alle im Folgenden gezeigten
Aggregationsmessungen wurden mit diesen Konzentrationen durchgeführt, außer es wird eine
ausdrückliche Abweichung erwähnt.
4.2.2 ADP-induzierte Aggregation
4.2.2.1 Normaler Verlauf einer ADP-induzierten Aggregation
Nach Zugabe von ADP zum PRP eines gesunden Probanden zeigt sich folgender regelmäßiger
Ablauf einer Aggregation:
Aggregation [%]
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
0 30 60 90 120 150 180
t [s]
Abb. 2: Typische ex vivo Aggregationskurve
eines gesunden Probanden nach
Zugabe von 20 µM ADP zum PRP
Direkt nach Zugabe des Stimulus (erkennbar an dem kurzen negativen Peak, verursacht durch das
Eindringen der Pipettenspitze in das Aggregationsröhrchen) kann häufig ein kleiner Ausschlag der
Kurve ins Negative beobachtet werden (in Abb. 2 nicht sichtbar). Dieser Ausschlag kann dem
shape change der Thombozyten gleichgesetzt werden. Nach diesem Ereignis folgt ein steiler
Anstieg der Kurve. Bei niedrigen ADP-Konzentrationen (ca. 5-10 µM) kann nachfolgend – abhängig
vom Probanden – gelegentlich ein Abfall der Kurve beobachtet werden, was eine inkomplette,
reversible Aggregation wiederspiegelt. Bei ausreichend hoher ADP-Konzentration (20 µM für alle
Probanden) kommt es jedoch zu einem längerdauerndern Anstieg des Wertes, der schließlich auf
42

dem für den jeweiligen Probanden spezifischen Maximum in ein Plateau übergeht und dort –
irreversibel – bestehen bleibt.
4.2.2.2 Verlauf einer ADP-induzierten Aggregation nach Einahme von Ticlopidin oder
Clopidogrel
Sowohl Ticlopidin als auch Clopidogrel bewirkten nach einer Einnahmedauer von 7 Tagen eine
nahezu komplette Inhibition der ADP-induzierten Aggregation ex vivo. Der shape change, eine
Konformationsänderung des Thrombozyten, kann allerdings nach wie vor beobachtet werden.
Aggregation [%]
80
60
40
20
0
-20
0 30 60 90 120 150 180
t [s]
Abb. 3: Repräsentative Aggregationskurven
von einem Probanden aus der
Clopidogrel-Studie. Die Aggregation
wurde ex vivo durch die Zugabe von
20 µM ADP ausgelöst. Rot: vor
Clopidogrel; Blau: Nach 7 Tagen
Einnahme von Clopidogrel; Grün: 3
Wochen nach Ende der
Clopidogreleinnahme.
4.2.2.3 Wirksamkeit von Ticlopidin und Clopidogrel
Bei einem Probanden (ein 23-jähriger gesunder und normalgewichtiger Mann) in der Clopidogrel-
Studie konnte trotz nachgewiesener korrekter Einnahme des Wirkstoffes kein Effekt auf die
Aggregation festgestellt werden. Der Proband hatte keine offensichtlichen Abnormalitäten im
Blutbild oder in den Thrombozyten-Funktionen. Dieser Mann wurde als 'Non-responder’ nicht in die
Analyse der Daten einbezogen. Bei allen anderen Probanden ergab sich zusammenfassend
folgendes Bild:
43

in % (rel. zu `vor`)
4.2.2.4 Zeitverlauf der Ticlopidin-Wirkung
Abb. 4: Zusammenfassung
der Wirkung von Ticlopidin
und Clopidogrel auf die
ADP-induzierte Aggregation.
Aufgetragen sind die
maximalen Aggregationswerte
während der 4minütigen
Messung (n=4 für
Ticlopidin,
Clopidogrel).
n=5 für
Die nur im Fall der Ticlopidin-Stidie durchgeführte Analyse des Zeitveraufes der Wirkung ergab
folgendes Ergebnis:
Aggregation in %
(rel. zum Tag 0)
150
100
50
0
120
80
40
0
vor nach 7
Tagen
3 oder 4
Wochen
danach
Ticlopidine
Clopidogrel
0 4 8 12 16 20 24
Tage
Abb. 5: Zeitverlauf der
Wirkung von Ticlopdin
(Einnahme Tag 1-7). Als
Vergleich die Kontrollwerte
des Non-Responders. Aufgetragen
sind wiederum die
maximalen Aggregationswerte
während der 4minütigen
Messung (n=3).
Bereits nach 3 Tagen bewirkte Ticlopidin eine deutliche Verminderung der ADP-induzierten
Aggregation. Nach 7 Tagen war die durch ADP hervorgerufene Aggregation deutlich vermindert.
Der Effekt auf die Aggregation hielt auch nach Absetzen des Wirkstoffes für mehrere Tage an, ehe
in der folgende Woche eine Rückkehr der Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten beobachtet
werden konnte, die schließlich nach 3 Wochen den Ausgangswert vor der Einnahme von Ticlopidin
wieder erreicht hatte.
44

4.2.3 Synergistische Effekte von ADP und Epinephrin
In Vorstudien konnte ein Synergismus von ADP und Epinephrin festgestellt werden. Epinephrin
alleine konnte in keiner der getesteten Konzentration (0,55-55 µM) einen shape change oder eine
Aggregation auslösen. Niedrige Konzentrationen an ADP (2.5 µM) konnten alleine zwar einen
shape change auslösen, jedoch nie eine Aggregation. Bei gleichzeitiger Zugabe beider Reagenzien
in niedrigen Konzentrationen konnte allerdings eine Aggregation ausgelöst werden, die im
allgemeinen mindestens das Ausmaß einer Aggregation von 20 µM ADP alleine erreichte.
Nach 7-tägiger Einnahme von Clopidogrel war dieser synergistische Effekt nicht mehr nachweisbar.
in % (rel. zu 'vor')
110
80
50
20
-10
vor 7 Tage 4 Wochen nach
Einnahme
Abb. 6: Synergistische Effekte
von 2.5 µM ADP und 3 µM
Epinephrin vor, nach 7 Tagen
Clopidogrel-Einnahme und 3
Wochen danach. Aufgetragen
sind die maximalen
Aggregationswerte während
der 4-minütigen Messung.
4.2.4 Thrombin- und U46610-induzierte Aggregation
Neben ADP ist es auch möglich, mit Thromboxan bzw. seinem Analogon U46610 oder mit
Thrombin eine irreversible Aggregation auszulösen.
Sowohl in der Ticlopidin-Studie als auch in der Clopidogrel-Studie wurden alle PRP-Proben der
Probanden auch mit diesen beiden Substanzen stimuliert.
In keiner der beiden Studien konnte ein signifikanter Unterschied in der Aggregation vor, während
oder nach der Einnahme von entweder Ticlopidin oder Clopidogrel festgestellt werden. Zwar zeigte
sich ein leichter Abfall der Aggregation nach Stimulation mit U46610 unter Einnahme von
Clopidogrel und Ticlopidin, dieser erreichte aber keine signifikante Änderung.
45

4.3 Ergebnisse der intrazellulären Kalziummessungen in Thrombozyten
4.3.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619 und Thrombin für die ex vivo
durchgeführten Kalziummessungen
Da die Konzentrationen der verschiedenen Substanzen, die zur Auslösung einer maximalen ex vivo
Kalzium-Freisetzung bzw. eines Kalzium-Einstoms benötigt werden, ähnlich wie bei der
Aggregation individuelle Unterschiede zeigten, wurden in Vorversuchen an verschiedenen
gesunden Probanden die Konzentrationen bestimmt, die mit größter Wahrscheinlichkeit ein
maximales Kalzium-Signal für alle Probanden auslösen. Diese Konzentrationen betrugen 1 µM
ADP, 0,1 µM U-46619 und 0,1 U/ml Thrombin. Alle im Folgenden gezeigten Messungen wurden mit
diesen Konzentrationen durchgeführt.
4.3.2 Normaler Verlauf einer ADP-induzierten Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären
Speichern von Thrombozyten
Nach Zugabe von ADP zu den Thrombozyten eines gesunden Probanden zeigt sich in Gegenwart
von 1 mM EGTA folgender regelmäßiger Ablauf einer intrazellulären Kalzium-Freisetzung:
I [arbitrary units]
800
700
600
500
400
0 30 60 90
t [s]
Abb. 7: Typische Kalzium-Freisetzung von
Thrombozyten eines gesunden Probanden
nach Zugabe von 1 µM ADP in
Gegenwart von 1 mM EGTA im
extrazellulären Medium.
Direkt nach Zugabe des ADP (nach 10 s Messung zur Bestimmung eines stabilen Basiswertes =
Pfeil) konnte ein Anstieg der Fura-2-Fluoreszenz gemessen werden, der einem Anstieg der
intrazellulären Kalzium-Konzentration gleichgesetzt werden kann. Nach 4 Sekunden wird ein
maximaler Wert erreicht, der dann in einem protrahierten Abfall nach ca. 45 Sekunden wieder den
Ausgangswert erreicht.
46

4.3.3 Normaler Verlauf einer ADP-induzierten Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären
Speichern von Thrombozyten und einem zusätzlichen Einstrom von extrazellulärem Kalzium
Nach Zugabe von ADP zu den Thrombozyten eines gesunden Probanden zeigt sich in Gegenwart
von 1 mM CaCl2 folgender regelmäßiger Ablauf eines Kalzium-Signals:
I [arbitrary units]
800
700
600
500
400
0 30 60 90
t [s]
Abb. 8: Typisches Kalzium-Signal von
Thrombozyten eines gesunden
Probanden nach Zugabe von 1 µM ADP
in Gegenwart von 1 mM CaCl2 im
extrazellulären Medium.
Dem oben beschrieben Signal der Kalzium-Freisetzung wird hier das Signal eines schnellen und
kurzen Kalzium-Influxes zusätzlich überlagert. Der Charakter des Rezeptor-vermittelten Kalzium-
Einstoms zeigt sich in der typischen Kinetik des Signals: Bereits in der ersten Sekunde nach
Zugabe des ADP (Pfeil) kommt es zu einem steilen Anstieg des Floureszenz-Signales, der ein
früheres Maximum (nach 2 Sekunden) zur Folge hat als bei der Kalzium-Freisetzung aus
intrazellulären Speichern. Der ebenfalls schnelle Abfall des Kalzium-Einfluxes, verursacht durch
eine Desensitierung des Rezeptors und aktiven Kalziumtransports aus dem Zytosol vermittels
Kalzium-ATPasen, wird bei dieser Methode der Messung durch das nun einsetzende Signal der
Kalzium-Freisetzung (vgl. oben) verdeckt.
4.3.4 Verlauf der ADP-induzierten Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern von
Thrombozyten während der Einnahme von Ticlopidin oder Clopidogrel
Nach 7-tägiger Einnahme der Wirkstoffe konnte bei keinem der Probanden eine Veränderung der
Kinetik der Kalzium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern festgestellt werden.
47

I [arbitrary units]
800
700
600
500
400
0 30 60 90
t [s]
Abb. 9: Repräsentative Fura-2-
Fluoreszenzkurven von einem Probanden
aus der Ticlopidin-Studie. Die Kalzium-
Freisetzung wurde ex-vivo durch die
Zugabe von 1 µM ADP in der Gegenwart
von 1 mM EGTA ausgelöst. Blaue Kurve:
vor Ticlopidin; pink-farbene Kurve: 7 Tage
Ticlopidin; grüne Kurve: 2 Wochen nach
Ticlopidin.
4.3.5 Verlauf der ADP-induzierten Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern von
Thrombozyten und einem zusätzlichen Einstrom von extrazellulärem Kalzium während der
Einnahme von Ticlopidin oder Clopidogrel
Der schnelle Kalzium-Einstrom in Thrombozyten konnte auch nach der 7-tägigen Einnahme von
Ticlopidin oder Clopidogrel ausgelöst werden.
I [arbitrary units]
800
700
600
500
400
0 30 60 90
t [s]
Abb. 10: Repräsentative Fura-2-
Floureszenzkurven von einem
Probanden aus der Ticlopidin-Studie.
Das Kalzium-Signal wurde ex-vivo
durch die Zugabe von 1 µM ADP in der
Gegenwart von 1 mM CaCl2 ausgelöst.
Blaue Kurve: vor Ticlopidin; pinkfarbene
Kurve: 7 Tage Ticlopidin; grüne
Kurve: 2 Wochen nach Ticlopidin.
4.3.6 Thrombin- und U46610-induzierte Kalzium-Antworten
Neben ADP ist es auch möglich, mit Thromboxan bzw. U46610 und Thrombin sowohl einen
Kalzium-Einstrom als auch eine Kalzium-Freisetzung auszulösen.
48

Sowohl in der Ticlopidin-Studie als auch in der Clopidogrel-Studie wurden alle Proben der
Probanden auch mit diesen beiden Substanzen stimuliert.
In keiner der beiden Studien konnte ein Unterschied in der Kalzium-Antworten vor, während oder
nach der Einnahme von entweder Ticlopidin oder Clopidogrel festgestellt werden.
4.4 Ergebnisse der cAMP-Bestimmungen in Thrombozyten
4.4.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, Epinephrine, PG-E1 und U-46619 für die ex
vivo durchgeführten cAMP-Messungen in Thrombozyten
Da im Fall der cAMP-Bestimmungen der Einfluß der Hemmung von ADP, U-46619 und Epinephrin
auf die Produktion von cAMP durch die Adenylcyclase gemessen werden sollte, wurde diese
zunächst durch Zugabe von PG-E1 stimuliert. Die mimimalen Konzentrationen dieser Substanzen,
mit denen ein maximaler und sicher bei allen getesteten Probanden reproduzierbarer Effekt erreicht
werden konnte, wurde in mehreren Messungen vorher an eine Reihe von gesunden Probanden
bestimmt: Für ADP war diese Konzentration 5 µM, für U-46619 1 µM, für Epinephrin 55 µM und für
PG-E1 30 nM.
4.4.2 ADP-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten Adenylcyclase
4.4.2.1 Normales Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit ADP und PG-E1 stimulierten
Thrombozyten
fmol [cAMP]
30
20
10
0
Co PG-E1 ADP PG-E1 +
ADP
Abb. 11: Repräsentatives
Ergebnis eines typischen
Stimulationsschemas mit 5
µM ADP und 30 nM PG-E1
an Thrombozyten eines
gesunden Probanden.
Der basale cAMP-Spiegel von ruhenden Thombozyten wird durch Zugabe von ADP nicht verändert.
Wenn dagegen die Adenylcyclase mit PG-E1 stimuliert wird, kommt es – abhängig vom
individuellen Probanden – zu einem 4-10-fachen Anstieg des cAMP-Spiegels. Dieser Anstieg kann
durch gleichzeitige Zugabe von ADP fast völlig aufgehoben werden.
49

4.4.2.2 Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit ADP und PG-E1 stimulierten
Thrombozyten während der Einnahme von Ticlopidin oder Clopidogrel
Nach 7-tägiger Einnahme von Ticlopidin oder Clopidogrel ergab sich folgendes Bild:
cAMP (rel. zur ADP-Kontrolle 'vor')
12
8
4
0
vor 7 Tage
Clopidogrel
4 Wochen
danach
Abb. 12: Zusammenfassung der Wirkung
von Ticlopidin und Clopidogrel auf die
ADP-induzierte Inhibition der
Adenylylcyclase. Schwarze Balken:
unstimulierte Thrombozyten. Weiße
Balken: Stimulation mit 30 nM PG-E1.
Schraffierte Balken: Gleichzeitige
Stimulation mit 30 nM PG-E1 und 5 µM
ADP. Alle Werte relativ zur Kontroll-
Stimulation mit 5 µM ADP.
Ticlopidin und Clopidogrel veränderten nicht signifikant den basalen cAMP-Spiegel in den
Thrombozyten. Ebenfalls konnte kein signifkanter Unterschied der cAMP-Werte nach PG-E1-
Stimulierung festgestellt werden. Dagegen konnte eine fast vollständige Hemmung des
inhibitorischen Effektes von ADP auf den PG-E1-vermittelten cAMP-Anstieg nach 7-tägiger
Einnahme der Wirkstoffe beobachtet werden. Diese Effekte waren nach 4 Wochen wieder völlig
aufgehoben.
Die Messwerte wurden insgesamt durch hohe individuelle Schwankungen in der Fähigkeit von PG-
E1, den cAMP-Spiegel zu erhöhen, und die hohe Störanfälligkeit des RIA beeinträchtigt.
4.4.3 Epinephrin-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten Adenylcyclase
4.4.3.1 Normales Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit Epinephrin und PG-E1
stimulierten Thrombozyten
Ähnlich dem ADP bewirkt auch Epinephrin eine Inhibition der durch PG-E1-stimulierten
Adenylylcyclase, ohne dabei den basalen cAMP-Spiegel zu verändern.
50

fmol [cAMP]
30
20
10
0
Abb. 13: Repräsentatives
Ergebnis eines typischen
Stimulationsschemas mit 55
µM Epinephrin und 30 nM
PG-E1 an Thrombozyten
eines gesunden Probanden.
4.4.3.2 Verhalten des cAMP-Spiegels in ex vivo mit Epinephrin und PG-E1 stimulierten
Thrombozyten während der Einnahme von Clopidogrel
Die nur im Falle der Clopidogrel-Studie durchgeführten Messungen mit Epinephrin ergaben
folgendes Ergebnis:
cAMP (rel. zur
Epinephrine-Kontrolle 'vor')
9
6
3
0
Co PG-E1 Epinephrin PG-E1 +
Epinephrin
vor 7 Tage
Clopidogrel
4 Wochen
danach
Abb. 14 : Zusammenfassung der
Wirkung von Clopidogrel auf die
Epinephrin-induzierte Inhibition der
Adenylylcyclase. Schwarze Balken:
unstimulierte Thrombozyten. Weiße
Balken: Stimulation mit 30 nM PG-
E1. Schraffierte Balken:
Gleichzeitige Stimulation mit 30 nM
PG-E1 und 55 µM Epinephrin. Alle
Werte relativ zur Kontroll-
Stimulation mit 55 µM Epinephrin.
Clopidogrel bewirkte keine Verminderung der inhibitorischen Wirkung von Epinephrin auf die PG-
E1-vermittelte cAMP-Erhöhung.
51

4.5 Ergebnisse der Untersuchung der VASP Phosphorylierung in Thrombozyten
4.5.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619, PG-E1 und Epinephrin für die ex
vivo durchgeführten Messungen der VASP-Phosphorylierung in Thrombozyten
Da im Fall der VASP-Phosphorylierung parallel zur Bestimmung des cAMP-Spiegels der Einfluß der
Hemmung von ADP und Epinephrin auf die Phosphorylierung von VASP durch die Protein-Kinase
A gemessen werden sollte, wurde diese durch Zugabe von PG-E1, das den cAMP-Spiegel erhöht,
stimuliert. Die mimimalen Konzentrationen dieser Substanzen, mit denen ein maximaler und sicher
bei allen getesteten Probanden reproduzierbarer Effekt erreicht werden konnte, wurde in mehreren
Messungen vorher an eine Reihe von gesunden Probanden bestimmt: Für PG-E1 war diese
Konzentration 30 nM, für ADP 5 µM und für Epinephrin 55 µM.
4.5.2 ADP-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten VASP-Phosphorylierung
4.5.2.1 Normales Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo mit ADP und PG-E1
stimulierten Thrombozyten
Prinzipiell standen zur Bestimmung der VASP-Phosphorylierung zwei Antikörper zur Verfügung.
Der polyklonale Antikörper Anti-VASP-M4 erkennt VASP unabhängig von seinem
Phosphorylierungszustand. Eine Phosphorylierung am Serin 157 von VASP kann an einem
Molekuargewichts-shift im Polyacrylamidgel von 46kD (entspricht nicht phosphoryliert) nach 50kD
(entspricht phosphoryliert am Serin 157) erkannt werden. Für die Bestimmung der
Phosphorylierung am Serin 239, die keinen shift bewirkt, stand der monoklonale Anitkörper Anti-
Phospho-VASP-16C2 zur Verfügung. Dieser Antikörper ist spezifisch gegen die Phosphorylierung
am Serin 239 gerichtet und erkennt das unphosphorylierte Protein nicht.
Alle im weiteren aufgeführten Western-Blot-Abbildungen zeigen immer wieder den gleichen Aufbau
mit vier aufeinanderfolgenden Spuren: Spur 1 zeigt nicht-stimulierte Kontroll-Thrombozyten, Spur 2
mit 30 nM PG-E1-stimulierte Thrombozyten, Spur 3 mit 5 µM ADP versetzte Thrombozyten und
Spur 4 mit 30 nM PG-E1 und 5 µM ADP gleichzeitig versetzte Thrombozyten.
Dabei ergeben sich folgende Muster:
Abb. 15: Westernblot mit dem Erstantikörper Anti-VASP M4. Repräsentatives
Ergebnis eines typischen Stimulationsschemas mit 5 µM ADP und 30 nM PG-E1
an Thrombozyten eines gesunden Probanden.
1 2 3 4
Spur 1: Unstimulierte Thrombozyten. Spur 2: Stimulation mit 30 nM PG-E1. Spur
3: Stimulation mit 5 µM ADP. Spur 4: Gleichzeitige Stimuation mit 30 nM PG-E1 und 5 µM ADP.
52

1 2 3 4
Abb. 16: Westernblot mit dem Erstantikörper Anti-VASP 16C2. Repräsentatives
Ergebnis eines typischen Stimulationsschemas (vgl. Abb. 15) mit 5 µM ADP und
30 nM PG-E1 an Thrombozyten eines gesunden Probanden.
In unstimulierten Thrombozyten kann mit dem AK M4 und dem AK 16C2 keine Phosphorylierung
nachgewiesen werden: entsprechend zeigt sich im ersten Fall nur eine 46 kD Bande, im zweiten
Fall keine Bande.
Bei Stimulierung mit 30 nM PG-E1 kommt es sowohl zu einer Phosphorylierung am Serin 157
(erkennbar durch eine Doppelbande 46/50 kD im M4-Blot) also auch zu einer Phosphorylierung am
Serin 239 (Doppelbande 46/50 kD im 16C2-Blot). Die Doppelbande im 16C2-Blot entsteht dadurch,
daß sowohl einfach-phosphoryliertes VASP (nur Serin 239 => kein Shift) als auch doppeltphosphoryliertes
VASP (Serin 239 und Serin 157 => shift) vorliegt.
ADP alleine bewirkt im Verhältnis zum Ruhezustand der präparierten Thrombozyten keine
Veränderungen des Phosphorylierungszustandes.
Bei gleichzeitiger Zugabe von ADP und PG-E1 kann ADP die VASP-Phosphorylierung sowohl am
Serin 157 als auch am Serin 239 fast völlig verhindern.
4.5.2.2 Verhalten der VASP-Phosphorylierung ex vivo mit ADP und PG-E1 stimulierten
Thrombozyten während der Einnahme von Ticlopidin oder Clopidogrel
Nach 7-tägiger Einnahme von Ticlopidin oder Clopidogrel ergab sich folgendes Bild:
a b c
Abb. 17: Typisches Phosphorylierungsmuster
(vgl. Abb. 15) eines Probanden aus der
Ticlopidin-Studie. Ab: M4. a: vor Ticlopidin-
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Einnahme. b: nach 7-tägiger Einnahme von
Ticlopidin. c: 3 Wochen nach Einnahme von Ticlopidin. (Nummerierung s.o.)
a b c
Abb. 18: Typisches Phosphorylierungs-
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
muster (vgl. Abb 16) eines Probanden aus
der Clopidogrel-Studie. Ab: 16C2 a: vor
Clopidogrel-Einnahme. b: nach 7-tägiger
Einnahme von Clopidogrel. c: 3 Wochen nach Einnahme von Clopidogrel. (Nummerierung s.o.)
Ticlopidin als auch Clopidogrel bewirkten keine Anderung der basalen VASP-Phosphorylierung.
Auch die PG-E1-vermittelte VASP-Phosphorylierung am Serin 157 als auch am Serin 239 waren
unverändert. Hingegen zeigte sich ein deutlicher Effekt in Bezug auf das inhibitorische Potential von
53

ADP: Unter Ticlopidin- oder Clopidogrel-Einnahme ist der inhibitorische Effekt von ADP auf die PG-
E1-vermittelte VASP-Phosphorylierung praktisch aufgehoben, was sich sowohl in der nun
vorhandenen Phosphorylierung am Serin 157 als auch am Serin 239 zeigt.
Vier Wochen nach Einnahme der Wirkstoffe war die ADP-Wirkung vollständig wiederhergestellt.
Im Bezug auf die Phosphorylierung am Serin 239 ergab sich zusammenfassend in der Clopidogrel-
Studie folgendes Bild:
VASP-Phosphorylierung
(rel. zur ADP-Kontrolle)
30
20
10
0
vor
Clopidogrel
7 Tage
Clopidogrel
4 Wochen
danach
Abb. 19: Effekt von Clopidogrel auf
die PG-E1- und ADP-regulierte
VASP-Serin 239-Phosphorylierung.
Schwarze Balken: unstimulierte
Thrombozyten. Weiße Balken:
Stimulation mit 30 nM PG-E1.
Schraffierte Balken: Gleichzeitige
Stimulation mit 30 nM PG-E1 und 5
µM ADP. Alle Werte relativ zur
Kontroll-Stimulation mit 5 µM ADP.
4.5.3 Epinephrin-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten VASP-Phosphorylierung
4.5.3.1 Normales Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo mit Epinephrin und PG-E1
stimulierten Thrombozyten
Ähnlich dem ADP bewirkt auch Epinephrin eine Inhibition der durch PG-E1-vermittelten VASP-
Phosphorylierung sowohl am Serin 157 als auch am Serin 239, ohne dabei den PG-E1-vermittelten
Phosphorylierungsstatus zu verändern.
Abb. 20: Western-Blot mit dem Erstantikörper 16C2. Repräsentatives
Ergebnis eines typischen Stimulationschemas (vgl. Abb 16) mit 30 nM PG-E1
und 55 µM Epinephrin an Thrombozyten eines gesunden Probanden. Spur 1:
1 2 3 4
Unstimulierte Thrombozyten. Spur 2: Stimulation mit 30 nM PG-E1. Spur 3:
Stimulation mit 55 µM Epinephrin. Spur 4: Gleichzeitige Stimuation mit 30nM PG-E1 und 55 µM Epinephrin.
54

4.5.3.2 Verhalten der VASP-Phosphorylierung ex vivo mit Epinephrin und PG-E1 stimulierten
Thrombozyten während der Einnahme von Clopidogrel
Die nur im Falle der Clopidogrel-Studie durchgeführten Stimulationsversuche mit Epinephrin
ergaben folgendes Ergebnis:
a b c
Abb. 21: Typisches Phosphorylierungs-
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
muster (vgl. Abb 20) eines Probanden aus
der Clopidogrel-Studie. Ab: 16C2 a: vor
Clopidogrel-Einnahme. b: nach 7-tägiger
Einnahme von Clopidogrel. c: 3 Wochen nach Einnahme von Clopidogrel.
Clopidogrel bewirkte keine Verminderung der inhibitorischen Wirkung von Epinephrin auf die
Phosphorylierung von VASP am Serin 239.
Zusammenfassend ergab sich folgendes Ergebnis:
VASP-Phosphorylierung
(rel. zur Epinephrine-Kontrolle
30
20
10
0
vor
Clopidogrel
7 Tage
Clopidogrel
4 Wochen
danach
Abb. 22: Effekt von Clopidogrel auf
die PG-E1- und Epinephrinregulierte
VASP-Phosphorylierung.
Schwarze Balken: unstimulierte
Thrombozyten. Weiße Balken:
Stimulation mit 30 nM PG-E1.
Schraffierte Balken: Gleichzeitige
Stimulation mit 30 nM PG-E1 und
55 µM Epinephrin . Alle Werte
relativ zur Kontroll-Stimulation mit
55 µM Epinephrin.
55

4.6. Konstruktion der in dieser Arbeit verwendeten Plasmide
4.6.1 Klonierung der cDNA von P2Y1
Beschreibung: Dieses Plasmid enthält die komplette codierende Sequenz des humanem P2Y1-
Rezeptors inklusive eines 48 bp-Segmentes am 5’ Ende sowie eines 44 bp-Segmentes am 3’ Ende.
Konstruktion: Nach Gewinnung von RNA aus humanen Thrombozyten und anschließender cDNA-
Herstellung wurde diese als Vorlage für eine PCR mit den Primern GIK 88 und GIK 89 verwendet.
Die Pfu-Polymerase wurde wegen ihrer Proof-Reading-Fähigkeit verwendet, d.h. dieses Enzym
besitzt die Möglichkeit, bei der DNA-Synthese eventuell entstehende Fehler selbst zu korrigieren.
Da diese Polymerase sogennante blunt-ends, d.h. “glatte” Enden ohne Basenüberhang, produziert,
wurde das Produkt, ein ca. 1,1 kb großes Fragment, in den Klonierungsvektor pPCR-Script SK (+)
kloniert. Dieser Vektor eignet sich besonders für die Klonierung von blunt-ended-Fragmenten, da
die Multiple Cloning Site (MCS) eine Schnittstelle für Srf I besitzt, ein Enzym, das ebenfalls glatte
Enden produziert. Die den Rezeptor beinhaltenden Plasmide wurden komplett sequenziert mit den
Primern T3 und T7 sowie mit den internen Primern GIK 96, GIK 97 und GIK 98 und mit Hilfe der in
der NCBI-Datenbank veröffentlichten Sequenz als komplett und vollständig übereinstimmend
verifiziert.
4.6.2 Klonierung der cDNA von P2X1
Beschreibung : Dieses Plasmid enthält die komplette codierende Sequenz des humanen P2X1-
Rezeptors inklusive eines 66 bp-Segmentes am 5’-Ende sowie eines 53 bp-Segmentes am 3’-
Ende.
Konstruktion: Die Rezeptor-codierende Sequenz wurde parallel zu der oben für die Klonierung des
P2Y1- beschriebenen Methode aus Thrombozyten-RNA gewonnen. Die für die PCR verwendeten
Primer waren GIK 99 und GIK 100. Die PCR lieferte ein ca. 1.2 kb großes Fragment, das ebenfalls
in den Vektor pPCR-Script SK (+) kloniert wurde. Die Fragmente wurden mit den Primern T3 und
T7 sowie mit den internen Primern GIK 110, GIK 111, GIK 112, GIK 113 sowie GIK 114 komplett
sequenziert und mit Hilfe der in der NCBI-Datenbank veröffentlichten Sequenz als komplett und
vollständig übereinstimmend verifiziert.
4.7 Klonierung der Expressionsvektoren für P2Y1 und P2X1 / Epitope-Tagging der
Rezeptoren
Da für den immunologischen Nachweis von P2Y1- und P2X1-Rezeptoren zum Zeitpunkt der
Erstellung dieser Arbeit keine Antikörper erhältlich waren, wurden die beiden Rezeptoren “getaggt”,
d.h. es wurde eine kurze Aminosäure-Sequenz angefügt, die als Epitop von kommerziell
erhältlichen Antikörpern erkannt wird. Durch die Kürze des Epitops soll verhindert werden, daß die
56

Funktion des getaggten Proteins beeinflußt bzw. gestört wird. Mit Hilfe der gut charakterisierten
Antikörper kann dann eine Reihe anderer Methoden wie Western Blot, Immunpräzipitation, FACS
u.a. angewandt werden. Von der Vielzahl der erhältlichen Epitope wurden das FLAG-Epitop, das cmyc-Epitop,
das VSV-Epitop und das HA-Epitop verwendet.
4.7.1 FLAG-getaggte und c-myc-getaggte Rezeptoren
Für die Konstruktion dieser Plasmide wurde der Vektor pCMV-Tag1 (STRATAGENE) verwendet.
Dieser Vektor enthält bereits die Sequenzen für einen FLAG-Tag sowie einen c-myc-Tag. Die
FLAG-Sequenz kodiert für ein synthetisches Protein mit der Peptid-Sequenz DYKDDDDK, die cmyc-Sequenz
entspricht der Sequenz für das humane c-myc-Protein mit der Peptid-Sequenz
EQKLISEEDL (73). Durch entsprechende Klonierungsstrategien können mit diesem Plasmid
verschiedenste Konstellationen erreicht werden. Für beide Rezeptoren wurde ein FLAG-Epitop Nterminal
und C-terminal und sowie ein „Doppeltagging“ mit N-terminalem FLAG-Tag und Cterminalen
c-myc-Tag gewählt. Kritisch an diesen Klonierungen ist die Tatsache, daß bei der
Insertion der Rezeptor-cDNA auf ein intaktes Leseraster geachtet werden muß, um eine Expression
des Tag sicherzustellen. Im folgenden werden die klonierten Plasmide kurz beschrieben:
Abb. 23: Vektorkarte des pCMV-Tag1 sowie die Sequenz der Multiple Cloning Sites (MCS1 und
MCS2) und der bereits enthaltenen Tags FLAG und c-myc (147).
57

4.7.1.1 pCMV-P2Y1-N-Flag
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem N-terminalen FLAG-Tag. Für
die Klonierung eines N-terminal getaggten Proteins ist im Plasmid pCMV-Tag 1 eine Bgl II-
Schnittstelle unmittelbar hinter der FLAG-Sequenz vorgesehen. Da Bgl II auch die cDNA des
Rezeptors spaltet, wurde für die Amplifikation der dann mit Schnittstellen flankierten Rezeptoren-
DNA mit dem nicht-spaltenden Bcl I ein Isoschizomer gewählt, d. h. ein Enzym, daß eine andere
Erkennungssequenz hat, aber identische Überhänge liefert, so daß eine problemlose Ligation
möglich wird.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 101 und
GIK 102, die jeweils eine Bcl I-Schnittstelle enthalten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Bcl I
geschnitten und in den mit Bgl II geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert. Verschiedene Klone
wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pCMV-) P2Y1-N-Flag bezeichnet.
4.7.1.2 pCMV-P2Y1-C-Flag
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem C-terminalen FLAG-Tag. Für
die Klonierung eines C-terminal getaggten Proteins ist im Plasmid pCMV-Tag1 eine BamH I-
Schnittstelle direkt vor der für das FLAG-Epitop kodierenden Sequenz vorgesehen.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 103 und
GIK 140, die jeweils eine BamH I-Schnittstelle enthalten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit
BamH I geschnitten und in den ebenfalls mit BamH I geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert.
Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pCMV-) P2Y1-C-Flag
bezeichnet.
4.7.1.3 pCMV-P2Y1-N-Flag/C-c-myc
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem N-terminalen FLAG-Tag und
einem C-terminalen c-myc-Tag. Für dieses Doppeltagging ist entsprechend dem N-terminalen
FLAG-tagging eine Bgl II-Schnittstelle und eine beliebige Schnittstelle aus der MCS2 vorgesehen.
Es wurde Sal I gewählt, das die cDNA von P2Y1 nicht spaltet.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 101, der
eine Bcl I-Schnittstelle enthält (vgl. oben) und GIK 141, der eine Sal I-Schnittstelle enthält,
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Bcl I und Sal I geschnitten und in den mit Bgl II und Sal I
geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein
korrekter Klon mit (pCMV-) P2Y1-N-Flag/C-c-myc bezeichnet.
58

4.7.1.4 pCMV-P2X1-N-Flag
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2X1-Rezeptor mit einem N-terminalen FLAG-Tag.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2X1-cDNA mit den Primern GIK 142 und
GIK 143, die jeweils eine Bcl I-Schnittstelle enthalten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Bcl
I geschnitten und in den mit Bgl II geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert. Verschiedenen Klone
wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pCMV-) P2X1-N-Flag bezeichnet.
4.7.1.5 pCMV-P2X1-C-Flag
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2X1-Rezeptor mit einem C-terminalen FLAG-Tag.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2X1-cDNA mit den Primern GIK 144 und
GIK 148, die jeweils eine BamH I-Schnittstelle enthalten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit
BamH I geschnitten und in den ebenfalls mit BamH I geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert.
Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pCMV-) P2X1-C-Flag
bezeichnet.
4.7.1.6 pCMV-P2X1-N-Flag/C-c-myc
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2X1-Rezeptor mit einem N-terminalen FLAG-Tag und
einem C-terminalen c-myc-Tag.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2X1-cDNA mit den Primern GIK 142, der
eine Bcl I-Schnittstelle enthält (vgl. oben) und GIK 145, der eine Sal I-Schnittstelle enthält,
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Bcl I und Sal I geschnitten und in den mit Bgl II und Sal I
geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein
korrekter Klon mit (pCMV-) P2X1-N-Flag/C-c-myc bezeichnet.
4.7.2 HA-tagging von P2Y1
Zusätzlich wurden im Falle des P2Y1 Konstrukte mit einem HA-Tag entweder am N-terminalen
oder am C-terminalen Ende hergestellt. Die HA-Sequenz kodiert das human influenza
hemagglutinin-Protein mit der Peptid-Sequenz YPYDVPEDPED (73). Da für diesen Tag kein die
entsprechende Sequenz enthaltender Vektor vorhanden war, wurde er mittels PCR angefügt und in
den Expressionsvektor pcDNA3 kloniert.
59

Abb. 24: Vektorkarte des pcDNA3 sowie die Sequenz der Multiple Cloning Site (MCS) (71).
4.7.2.1 pcDNA3-P2Y1-HA-N
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem N-terminalen HA-Tag. Für die
Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamH I und Xho I gewählt, die beide
nicht in der cDNA von P2Y1 enthalten sind.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 158, der
eine BamH I-Schnittstelle, eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz sowie die für den HA-Tag
kodierende Sequenz enhält, und GIK 155, der eine Xho I-Schnittstelle enthält, mittels PCR
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit
60

BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-HA-N bezeichnet.
4.7.2.2 pcDNA3-P2Y1-HA-C
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem C-terminalen HA-Tag. Für die
Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamH I und Xho I gewählt (s.o.).
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 154, der
eine BamH I-Schnittstelle und eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz enthält, und GIK 159, der
eine Xho I-Schnittstelle und die für das HA-Epitop kodierende Sequenz enthält, mittels PCR
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit
BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-HA-C bezeichnet.
4.7.3 VSV-tagging von P2Y1
Weiterhhin wurden im Fall des P2Y1 auch Konstrukte mit einem VSV-Tag entweder am Nterminalen
oder am C-terminalen Ende hergestellt. Die VSV-Sequenz stammt aus dem vesicular
stomatitis virus glycoprotein G und codiert für die Peptidsequenz YTDIEMNRLGK (73). Da auch für
diesen Tag kein die entsprechende Sequenz enthaltender Vektor vorhanden war, wurde er
ebenfalls mittels PCR angefügt und in den Expressionsvektor pcDNA3 kloniert.
4.7.3.1 pcDNA3-P2Y1-VSV-N
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem N-terminalen VSV-Tag. Für
die Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamHI und XhoI gewählt (s.o.).
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 156, der
eine BamH I-Schnittstelle, eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz sowie die für den VSV-Tag
kodierende Sequenz enhält, und GIK 155, der eine Xho I-Schnittstelle enthält, mittels PCR
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit
BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-VSV-N bezeichnet.
4.7.3.2 pcDNA3-P2Y1-VSV-C
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem C-terminalen VSV-Tag. Für
die Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamH I und Xho I gewählt (s.o.).
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 154, der
eine BamH I-Schnittstelle und eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz enthält, und GIK 157, der
61

eine Xho I-Schnittstelle und die für das VSV-Epitop kodierende Sequenz enthält, mittels PCR
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit
BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-VSV-C bezeichnet.
4.7.4 Klonierung eines Expressionsvektors ohne Tags für P2Y1 (P2Y1-nat)
Beschreibung: Im Fall des P2Y1 wurde auch ein Expressionvektor kloniert, der nur die cDNA von
P2Y1 enthält. Als Vektor wurde wiederum pcDNA3 mit den Schnittstellen BamH I und Xho I
eingesetzt.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 154, der
eine BamH I-Schnittstelle und eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz enthält, und GIK 155, der
eine Xho I-Schnittstelle enthält, mittels PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und
Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert.
Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-nat
bezeichnet.
62

4.7.5 Zusammenfassung
Plasmid Vektor PCR-Produkt-
Schnittstellen
P2Y1-
N-FLAG
P2Y1-
C-FLAG
P2Y1-
N-FLAG/
c-myc
P2X1-
N-FLAG
P2X1-
C-FLAG
P2X1-
N-FLAG/
c-myc
P2Y1-
HA-N
P2Y1-
HA-C
P2Y1-
VSV-N
P2Y1-
VSV-C
Vektorschnittstellen
Rezeptor N-
terminaler
Tag
pCMV-Tag1 Bcl I / Bcl I Bgl II P2Y1 FLAG -
C-
terminaler
Tag
pCMV-Tag1 BamH I / BamH I BamH I P2Y1 - FLAG
pCMV-Tag1 Bcl I / Sal I Bgl II / Sal I P2Y1 FLAG c-myc
pCMV-Tag1 Bcl I / Bcl I Bgl II P2X1 FLAG -
pCMV-Tag1 BamH I / BamH I BamH I P2X1 - FLAG
pCMV-Tag1 Bcl I / Sal I Bgl II / Sal I P2X1 FLAG c-myc
pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 HA -
pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 - HA
pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 VSV -
pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 - VSV
P2Y1-nat pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 - -
Tab. 4 : Alle im Rahmen dieser Arbeit konstruierten Plasmide
4.8 TNT Quick Coupled Transcription / Translation System Expression der
Konstrukte
Als zusätzliche Absicherung zur Sequenzierung der klonierten Vektoren wurde der Ansatz der Invitro-Transkription
und -Translation zur Anwendung gebracht: Mit Hilfe des TNT Quick Coupled
Transcription / Translation System (PROMEGA) wurden ausgewählte Konstrukte auf ihre Fähigkeit
hin, exprimiert zu werden, überprüft.
63

1 2 3 4 5 6 7 8
Abb. 25: Autoradiographie der Elektrophorese der
TNT-translatierten Plasmide P2Y1-N-FLAG (Spur 1),
P2Y1-N-FLAG/C-c-myc (Spur 2), P2X1-C-FLAG (Spur
3), P2X1-N-FLAG/C-c-myc (Spur 4), Luciferase
(Positiv-Kontrolle) (Spur 5), Mix ohne Template
(Negativ-Kontrolle) (Spur 6), P2Y1-nat (Spur 7),
Luciferase (Positiv-Kontrolle) (Spur 8).
Die beiden Rezeptoren erscheinen im erwarteten Bereich ihres theoretisch kalkulierten molekularen
Gewichtes (ausgewertet durch den relativen Vergleich zur Laufgeschwindigkeit der Positivkontrolle,
s.u.). Durch die unterschiedlichen Tags kommt es allerdings zu einem überraschend deutlichen
Unterschied der einzelnen Konstrukte. Da auch die Positiv-Kontrolle (mitgeliefertes Luciferase-
Plasmid) im erwarteten Bereich von ca. 60 kDa auftaucht sowie die Spur mit der Negativ-Kontrolle
(kein Vektor zugegeben, aber Reaktionsmix mit Radioaktivität zupippetiert) keine Bande aufweist,
kann von einem Funktionieren sowohl der Reaktion als auch der Rezeptor-Plasmide ausgegangen
werden.
4.9 Expression in zellulären Systemen
Prinzipiell können Plasmide auf zwei verschiedene Arten in Zellen exprimiert werden: transient oder
stabil. Transiente Expression ist gekennzeichnet durch eine kurzfristige, sehr starke
Überexpression des Konstruktes, da das Plasmid nach der Transfektion in vielfacher Ausführung in
der Zelle vorliegt. Die Expression beginnt ca. 1-2 Tage nach dem Transfektionsvorgang, und endet
nach ca. 4-6 Tagen, was auf eine Degradierung der Plasmid-DNA durch zelleigene Nukleasen
zurückzuführen ist. In Abhängigkeit vom Zelltyp und dem gewählten Transfektionsverfahren beträgt
der Anteil der exprimierenden Zellen zwischen 5 und 80 % (Transfektionseffizienz).
Bei der stabilen Expression setzt man die Zellen wenige Tage nach der Tansfektion unter
Selektionsdruck mit einem zelltötenden Antibiotikum (meist Neomycin/G418). Da die Plasmide ein
Resistenzgen enthalten, werde nur diejenigen Zellen länger als 10 Tage überleben, die die Vektor-
DNA spontan und in zufälliger Art und Weise in ihr Genom integriert haben. Diese Zellen werden
auf ihr Expressionsverhalten hin untersucht und in einem Re-Klonierungsschritt in eine homogene
Zelllinie überführt, die nun das gewünschte Protein weiter unter dem vektoreigenen Promoter
exprimiert, so daß von einer “stabilen Zelllinie” gesprochen wird: Nach der Zellteilung wird auch die
Tochterzelle die integrierte Plasmid-DNA enthalten und das gewünschte Protein exprimieren,
64

allerdings auf einem niedrigeren Niveau als bei der transienten Expression, da – abhängig von der
Anzahl der integrierten Vektor-DNAs – nicht mehr so viele Kopien wie bei der transienten
Expression vorliegen.
4.9.1 Transiente Expression
Die transiente Expression eignet sich – bedingt durch die starke Überexpression des Konstruktes -
insbesondere für Ansätze, in denen größere Mengen des Proteins benötigt werden, wie z.B. für
Western-Blots.
Da zum Zeitpunkt dieser Arbeiten noch keine veröffentlichen Daten zur einer heterologen
Expression der Rezeptoren P2Y1 und P2X1 vorlagen, mußte als erster Schritt die Expression des
Konstrukte verifiziert werden.
4.9.2 Immunologischer Nachweis durch Western-Blot-Technik
4.9.2.1 Versuch des Nachweises der Expression von P2Y1 mittels der Western-Blot-Technik
In diesem zunächst einfachsten technischen Verfahren werden die Zellen 3 Tage nach Transfektion
- nach Entfernung des Mediums und mehrmaligem Waschen mit PBS - mit heißer SDS-Stop-
Lösung direkt von der Petrischale gelöst und damit auch lysiert. Nach fakultativem mehrminütigem
Aufkochen der Probe kann diese direkt auf ein Polyacrylamid-Gel geladen werden und
entsprechend dem oben beschriebenen Western-Blot-Protokoll (siehe 3.1.6) kann nun versucht
werden, den Rezeptor mittels eines gegen den entsprechenden Tag gerichteten Antikörpers als
Bande im Gel nachzuweisen.
Leider konnte mit keinem der verschiedenen Tag-Antikörper eine Bande nachgewiesen werden.
Da eine der möglichen Ursachen für dieses Problem eine zu geringe Expression sein könnte,
wurde als Methode zur Konzentrierung der Probe die Immunpräzipitation verwendet.
Hier konnten dann - nach Weglassen des Aufkochschrittes – und bei Verwendung des
transfezierten P2Y1-VSV-C Konstruktes und des VSV-Antikörpers folgende Banden detekiert
werden:
65

97
67
57
45
40
27
1 2 3 4 5 6
Abb. 26: Immunpräzipitation mit dem VSV-Antikörper bei P2Y1-VSV-C
exprimierenden COS-7 Zellen. Spur 1: Proteinstandard, Spur 2: frei,
Spur 3: Zelllysat vor IP, Spur 4: Überstand des Präzipitats, Spur 5:
Präzipitat des VSV-Antikörpers in mit Lipofectamine-transfezierten P2Y1-
VSV-C in COS-7 Zellen, Spur 6: Präzipitat des VSV-Antikörpers in mit
Lipofectamine-transfeziertem Leervektor pcDNA3 in COS-7 Zellen.
Im Vergleich der Spur 5, den mit dem P2Y1-VSV-C Plasmid transfezierten Zellen, mit der Spur 6,
den nicht transfezierten Zellen, fallen zwei Unterschiede auf: eine zusätzliche Bande bei ca. 45 kD
sowie ein „verschmiertes“ Signal von 70 kD an bis zum oberen Rand des Geles. Die einzelne
Bande stellt vermutlich die native Form des Rezeptores dar, also die nicht durch Glykosilierungen
modifierte Aminosäurekette aus dem endoplasmatischen Retikulum. Die Bandengröße entspricht
daher auch in etwa der vorher kalkulierten Größe des Rezeptors von ca. 42 kD, da diese
Kalkulation auf der Länge und Zusammensetzung der Aminosäure-Sequenz basiert.
Das „verschmierte“ Signal von ca. 70 kD an aufwärts würde dann den unterschiedlich glykosylierten
Proteinen entsprechen. Die Aminosäuresequenz des P2Y1 beeinhaltet mehrere mögliche
Glykosylierungsstellen. In der Tat ist für verschiedene 7-Transmembran-Rezeptoren, die gykosyliert
werden, ein ähnliches Signal in Western-Blots gezeigt worden (57).
4.9.2.2 Nachweis der Expression von P2X1 mittels der Western-Blot-Technik
Die Methode des Western-Blot-Nachweises wurde auch für den P2X1-Rezeptor angewandt. Dieses
Protein erwies sich als stabiler und / oder höher exprimiert und konnte auch ohne
Immunpräzipitation regelmäßig und zuverlässig nachgewiesen werden. Die im Gel beobachtete
Bande stimmte mit dem vorher theroretisch kalkulierten Molekulargewicht von ca. 60 kD gut
überein.
66

97
67
57
45
40
27
1 2 3 4 5 6
Abb. 27: Western-Blot mit den unterschiedlichen P2X1-
Konstrukten exprimiert in COS-7 Zellen.
Spur 1-3: inkubiert mit dem anti-Flag-M2-Antikörper: Spur 1:
COS-7 Zellen-Lysat, transfeziert mit dem Leer-Vektor
pCMV-Tag1, Spur 2: COS-7 Zellen-Lysat, die das P2X1-N-
Flag Plasmid exprimieren, Spur 3: COS-7 Zellen-Lysat, die
das P2X1-N-Flag/C-c-myc Plasmid exprimieren,Spur 4:
Proteinstandard, Spur 5/6 inkubiert mit anti-c-myc-
Antikörper: Spur 5: COS-7 Zellen-Lysat, die das P2X1-N-
Flag/C-c-myc Plasmid exprimieren, Spur 6: COS-7 Zellen-
Lysat, transfeziert mit dem Leer-Vektor p-CMV-Tag 1.
Neben den leider vielen Hintergrundsbanden mit dem Anit-Flag-M2-Antikörper tritt in den Spuren 2
und 3 im Vergleich mit den nicht exprimierenden Zellen in der Spur 1 im Bereich von 60 kD jeweils
eine dicke Bande auf. Die Größe dieser Bande enspricht dem theoretisch kalkulierten Wert für den
P2X1 Rezeptor.
Da aber auch im Falle des P2X1 keine veröffentlichten Daten zur molekularen Größe vorlagen,
wurde zur Sicherheit auch der Nachweis des doppelt-getaggten Rezeptors P2X1-N-Flag/C-c-myc
mit derselben Probe und dem Antikörper Anti-c-myc durchgeführt. Dabei ergab sich das erwartete
Bild einer identisch laufenden Bande (Spur 5).
4.9.3 Nachweis der Expression mittels Immunfloureszenz
Als zuverlässige und einfache Methode hat die Immunfluoreszenz zusätzlich zum bloßen
Expressionsnachweis mittels Western-Blot den Vorteil, daß – zumindest in einem bestimmten
Umfang – auch Aussagen über das zelluläres und subzelluläres Verteilungsmuster getroffen
werden können.
4.9.3.1 Nachweis von P2Y1
Alle Konstrukte wurden transient in COS7 und 1321N1 Zelllinien exprimiert, wobei sich unabhängig
vom Zelltyp folgende Unterschiede im Expressionsmuster zeigten:
67

A
C
Abb. 28: Subzelluläre Lokalisation der von den Plasmiden P2Y1-N-Flag (A und B) und P2Y1-VSV-N (C)
sowie P2Y1-VSV-C (D) exprimierten P2Y1-Rezeptoren. Astrocytoma 1321 N1 – Zellen wurden mit den
jeweiligen Plasmiden transfeziert und mit dem anti-Flag M2 (A und B) oder dem anti-VSV-Antikörper P5D4
inkubiert und dann mit dem fluoreszenzmarkiertem Zweitantikörper Cy3 inkubiert (Vergrößerung in allen
Abbildungen: 100x).
Die nicht-transfezierten Zellen zeigten mit beiden Antikörpern keinerlei Anfärbung (nicht gezeigt).
Die mit dem Flag-Tag bzw. dem c-myc-Tag fusionierten P2Y1-Rezeptoren zeigten ein unerwartetes
Expressionsmuster: Man erkennt starke Signale in Form größerer „Kleckse“ perinukleär. Diese
Verteilung entspricht einem Färbemuster des endoplasmatischen Retikulums bzw. des Golgi-
Apparates. Daraus kann geschlossen werden, daß die normale Prozessierung des Proteins gestört
ist und der getaggte Rezeptor seinen Weg an die Zellmembran nicht finden kann.
Anders das Expressionsmuster der mit dem HA- bzw. VSV-Tag fusionierten Proteine: Man erkennt
ein Art „Sternenhimmel“-Muster. Sehr viele, kleinere, pünktchenförmige Signale überziehen
homogen die komplette Zelle. Die Lokalisation der Rezeptoren an der Zelloberfläche konnte durch
B
D
68

Kombination von Permeabilisierung/Nicht-Permabilisierung und Einsatz der N- oder C-terminal
getaggten Rezeptoren sicher bestätigt werden. Zudem war durch “Durch”-Fokussieren eine
Zuordnung zur membranständigen Expression möglich. Die Konstrukte P2Y1-VSV-N, P2Y1-VSV-
C, P2Y1-HA-N sowie P2Y1-HA-C zeigten alle ein gleichartiges zelluläres Expressionsmuster.
4.9.3.2 Nachweis von P2X1
Auch alle Konstrukte für P2X1 wurden mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. Hierbei zeigten die
Flag-getaggten bzw. mit dem c-myc-Tag versehenen Rezeptoren ein dem P2Y1-Rezeptor
identisches Verteilungsmuster mit den gleichen kleinen punktförmigen Signalen, die homogen die
ganze Zelle überziehen.
Abb. 29: Subzelluläre Lokalisation der von dem Plasmid P2X1-C-Flag
exprimierten P2X1-Rezeptoren. Astrocytoma 1321 N1 – Zellen wurden mit
dem Plasmid transfeziert und mit dem anti-Flag M2 Antikörper inkubiert
und dann mit dem fluoreszenzmarkiertem Zweitantikörper Cy3 inkubiert
(Vergrößerung: 100x).
4.9.4 Analyse mittels Durchflusszytometrie
Für die COS-7- Zellen, die transient P2Y1-VSV-N exprimierten, wurde auch ein Verfahren zum
Nachweis der Expression der Rezeptoren mittels Durchflusszytometrie etabliert. Dies ist eine
ausgezeichnete Methode, um auch mit transient exprimierenden Zellen biochemische Analysen,
wie z.B. die Analyse der VASP-Phosphorylierung, durchzuführen, da die transient exprimierenden
und damit für das Experiment entscheidenden Zellen von den nicht-exprimierenden Zellen mittels
eines fluoreszenzgekoppelten Anti-Tag-Antikörpers separiert werden können und somit davon
getrennt analysiert werden können.
Nach der Auswertung der Ergebnisse zeigte sich folgendes:
69

a. P2Y1-VSV-N
c. P2Y1-VSV-N +
ohne Erstantikörper
Antikörper P5D4
b.
pcDNA3 +
Antikörper P5D4
a.: M 1 = 0,2
b.: M 1 = 1,1
c.: M 1 = 52,0
Abb. 30: Durchflußzytometrische Analyse der P2Y1-VSV-N-Expression in COS-7-Zellen. Je 1 Well einer 6-
Well-Platte wurde für eine Messung verwendet. Auf den X-Achsen ist die Fluoreszenz aufgetragen, auf den
Y-Achsen die Zellzahl. Die Zahlen beschreiben den Prozentsatz an Zellen, die in dem eingezeichneten
Bereich M 1 liegen. a. Färbung ohne Erst-AK mit dem Ziege-anti-Maus-FITC-AK mit P2Y1-VSV-N
transfezierten COS-7 Zellen zur Hintergrundbestimmung des FITC-gekoppelten Zweit-AK. b. Färbung mit
dem AK P5D4 und dem Ziege-anti-Maus-FITC-AK mit pcDNA3-Leervektor transfezierten COS-7 Zellen. c.
Färbung mit dem AK P5D4 und dem Ziege-anti-Maus-FITC-AK mit P2Y1-VSV-N transfezierten COS-7 Zellen.
70

Mittels der nativen COS-7 Zellen wurde der Bereich der analysierten Signale („Gate”) festgelegt.
Die mit dem P2Y1-VSV-N Plasmid transfezierten COS-7 Zellen zeigten zwei unterschiedliche
Zellpopulationen: Die nicht transfezierten Zellen, die das niedrigere Fluoreszenz-Signal zeigen,
sowie die erfolgreich transfezierten Zellen, die den Rezeptor P2Y1-VSV-N exprimieren und somit
ein deutlich stärkeres Fluoreszenz-Signal liefern. Die zweite Population zeigt einen Anteil von ca.
50%, was der Transfektionsrate gleichgesetzt werden kann.
Die beiden zusätzlichen Kontrollen bestätigen dieses Ergebnis: In der Kontrolle mit einer
Tranfektion des Leer-Vektors pcDNA3, ansonsten aber identischer Probenbehandlung inklusive
Zugabe beider Antikörper konnte gezeigt werden, daß die Transfektionsprozedur keinen Einfluß auf
die Zellpopulation hat: Es erscheint nur das Signal der Population mit dem schwächeren
Fluoreszenzsignal. Dieses Signal ist auf einen durch die unspezifischen Bindungen des
fluoreszenz-gekoppelten Zeitantikörpers FITC-anti-mouse an die COS-7 Zellen zurückzuführen, wie
die zweite Kontrolle zeigt: Die mit dem P2Y1-VSV-N Plasmid transfezierten Zellen wurden ohne
Zugabe des anti-VSV-Antikörpers aber nach Zugabe des FITC-Antikörpers analysiert. Damit kann
der Umfang des Hintergrund-Signals analysiert werden.
4.9.5 Stabile Expression – Etablierung von Stabilen Zelllinien
Da mit den stabilen Zelllinien v.a. auch funktionelle Untersuchungen gemacht werden sollen, muß
die native Zelllinie ein wichtiges Kriterium erfüllen: Die Zellen dürfen nicht nur keine Expression von
P2Y1 und P2X1 zeigen, sondern dürfen zusätzlich auch kein Kalzium-Signal über andere purinerge
Rezeptoren aussenden, wenn sie mit ADP oder ATP stimuliert werden, da sonst eine klare
Zuordnung der Kalzium-Signale, die durch den P2Y1 oder P2X1 ausgelöst werden, nur sehr
schwer möglich wäre.
Nach umfangreicher Literatursuche und vielen eigenen Vorversuchen mit den Zelllinien COS-7,
HEK-239 und PTK-2, die alle nach Stimulation mit ATP oder ADP intrazellulär Kalzium freisetzen,
wurde schließlich eine humane Astrozytoma-Zellline mit dem Namen 1321N1 gewählt, für die
vorbeschrieben war, daß sie keinerlei purinerge Rezepetoren exprimiert (40). Dies konnte durch
eigene Versuche bestätigt werden: In den Einzelzell-Kalzium-Messungen konnte zu keinem
Zeitpunkt ein positives Signal nach ADP-Zugabe nachgewiesen werden. Als Positiv-Kontrolle für
ein regelmäßig auslösbares Kalzium-Signal konnte als Stimulanz Thrombin in einer Konzentration
von 0,5 U etabliert werden.
71

Die Herstellung der Zelllinien erfolgte nach folgendem Protokoll:
1. 1321N1 Zellen wurden mit den Konstrukten P2Y1-VSV-C, P2Y1-nat und P2X1-C-Flag
transfeziert.
2. Nach 48 Stunden wurde die Zellen gesplittet und auf eine 96-well-Platte so verdünnt, daß nur
einige wenige Zellen in jedem well vorlagen. Außerdem wurde G418 in der Konzentration von 1
µg/ml zugegeben. Diese Konzentration war in Vorversuchen ausreichend, um alle nicht
transfezierten Zellen innerhalb von 3-5 Tagen zu töten.
3. Nach regelmäßigem Mediumwechsel zeigte sich nach ca. 2 Wochen folgendes Bild: In
denjenigen wells, in denen Zellen die Selektion mit G418 überlebt hatten, verfärbte sich das
Medium 1-2 Tage nach letzmaligem Wechsel von rot nach gelb-orange als Zeichen des Verbrauchs
von Nährstoffen und dem damit verbundenen pH-Wert-Wechsel. Diese Zellen wurden auf größere
Platten expandiert: Erst auf 24-well-Platten, dann auf 12-well-Platten und schließlich auf 6-well-
Platten.
Für das Konstrukt P2Y1-VSV-C wurde ein Teil dieser Zellen dann für Immunfluoreszenzaufnahmen
genutzt. Da sich zum Zeitpunkt des Beginns der Selektion nicht nur eine Einzelzelle in einem well
befand, waren auch nach der Selektion nicht alle vorhandenen Zellen Nachfolger einer Zelle, also
„Klone“ dieser einen Zelle, sondern die Summe der Nachfolger verschiedener Ausgangszellen, die
recht unterschiedliche Expressionsmuster zeigen können, bzw. bei Integration von nur dem
Resistenzgen aus dem Plasmid ohne dem darin integrierten Rezeptor überhaupt keine Expression
zeigen.
Für den Nachweis des Konstruktes P2Y1-nat, das keinen Tag enthält und für das auch kein
Antikörper existiert, wurde die RT-PCR als Nachweisverfahren eingesetzt.
Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode zum Nachweis einer Expression. Allerdings ist sie eine
indirekte Art des Nachweises einer Expression, da nicht das Protein und damit das Endprodukt der
Translation nachgewiesen wird, sondern die Boten-RNA, das Produkt der Transskription. Somit
kann der letzte Schritt der Translation nicht nachgewiesen werden. Da aber erfahrungsgemäß die
Translation eines nativen Proteins ein eher unkritischer Schritt ist, kann im allgemeinen der
Nachweis der mRNA mit einer Expression des in der jeweiligen mRNA codierten Proteins
gleichgesetzt werden. Nach Präparation der RNA aus den Astrocytoma-Zellen wird zunächst der
sogenannte First-Strand mittels des Enzyms Reverse Transkriptase hergestellt. Dann wird mit den
spezifischen Primern GIK 160 und GIK 161 eine PCR gestartet, die als Produkt die fast komplette
codierende Sequenz des P2Y1 liefert.
72

Dabei ergab sich folgendes Bild:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Abb. 31: Ergebnis der RT-PCR von 10 Zelllinien (Spuren 2-
11) nach 3-wöchiger Selektion mit G418. Spur 12: Negativ-
Kontrolle (nicht transfezierte Zellen). Spur 13: Positiv-
Kontrolle (Vektor P2Y1-nat als PCR-Template). Spuren 1
und 14: DNA-Größenstandards.
Somit zeigen die Zelllinien 6 und 10 (Spur 7 und 11) eine Bande in der erwarteten Größe.
Für das Konstrukt P2X1-C-Flag wurde als Nachweismethode für die stabile Expression das
Western-Blot-Verfahren gewählt. Dabei zeigten von den insgesamt 20 getesteten Zellpopulationen
15 eine Expression des P2X1-C-Flag Rezeptors. Davon wurde 3 Zelllinien mit jeweils
unterschiedlich starker Expression für die Reklonierung ausgewählt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb. 32: Screening von Zelllinien, die das P2X1-C-
Flag-Konstrukt stabil exprimieren, mittels Western-
Blot (Antikörper Anti-Flag-M2). Spuren 1-8:
Astrozytoma-Zelllysate, die die Selektion mit G-418
tolerieren. Spur 9: Astrocytoma Zelllysat als
Negativ-Kontrolle. Spur 10: Astrozytoma-Zelllysat,
die das P2X1-N-Flag Plasmid transient
exprimieren.
Da zu Beginn der Selektion mehr als eine einzelne Zelle pro well vorhanden war, waren die
positiven Klone noch immer Mischklone mit zum Teil erheblichen Unterschieden im
Expressionsverhalten. Um echte Einzelzell-Klone zu erhalten, wurden die nach dem Screening
positiven Zellen nochmals auf 96-well-Platten verdünnt, diesmal so berechnet, daß höchstens eine
Zelle pro well vorliegen würde.
Die Zellen aus wells, die Zellwachstum zeigten, wurden dann einer erneuten Überprufung auf ihr
Expressionsverhalten unterzogen. Bei den mit Immunfluoreszenz nachweisbaren Konstrukten
(P2Y1-VSV-C und P2X1-C-Flag) zeigte sich nun ein homogener Expressionslevel der Zellen. Sie
wurden entsprechend oben beschriebenem Schema expandiert und ein Teil für spätere Versuche
kryokonserviert.
73

Da die RT-PCR keine Aussage über die individuelle Expression einer Zelle gibt, wurden die den
P2Y1-nat exprimierenden Zellen zunächst tiefgefroren und anschließend funktionell charakterisiert,
daß heißt in Einzelzell-Kalzium-Messungen wurden diejenigen Klone gewählt, die in mehrfach
reproduzierbaren Messungen gleichmäßige Signale in allen im Mikroskop darstellbaren Zellen
lieferten.
4.10 Pharmakologie der stabil exprimierten Rezeptoren P2Y1 und P2X1 in
Astrozytoma 1321N1 Zellen
Die nun vom Expressionsverhalten einheitlichen Zelllinien wurden dann im nächsten Schritt auf die
Funktionalität der exprimierten Rezeptoren hin untersucht. Da sowohl der P2Y1 als auch der P2X1
nach Stimulation mit ADP mit einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration antworten,
wurde als System zur Überprüfung der Funktion der Rezeptoren Kalzium-Einzelzell-Messungen
durchgeführt.
Zunächst wurde in Vorversuchen die ideale Konzentration für Fura-2 ermittelt, bei der die Kalzium-
Signale sicher reproduzierbar gemessen werden konnten, ohne daß die Zellen durch eine zu hohe
Konzentration an Fura-2 geschädigt wurden.
Für die Astrocytoma 1321N1 Zelllinie stellte sich dabei die Beladung der Zellen mit 4 µM Fura-2 für
30 Minuten bei 37°C als optimal heraus.
4.10.1 Native, nicht transfezierte Astrozytoma 1321N1 Zelllinie
Die native Astrozytoma 1321N1 Zelllinie zeigt nach Zugabe von Stimulanzien folgendes Verhalten:
ratio (340/380)
2500
2000
1500
1000
500
0
0 50 100
t [s]
150 200
Abb. 33: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der nativen Zelllinie Astrozytoma 1321
N1. Zugabe von 5µM ADP nach 45 s, 5 µM
ATP nach 90 s und 0,5 U Thrombin nach
140 s. Jede Kurve mit unterschiedlichem
Symbol repräsentiert das Kalziumsignal
einer einzelnen Zelle.
74

Mit ADP oder ATP lassen sich keine Kalzium-Signale aus den Zellen ableiten. Dies wurde in
vielfachen Vor-Versuchen demonstriert. Damit kann die aus der Literatur bekannte Abstinenz von
purinergen Rezeptoren auf dieser Zelllinie bestätigt werden (40).
Ein deutlich positives Kalzium-Signal konnte dagegen regelmäßig nach Stimulation der Zellen mit
Thrombin (0,5 U) gemessen werden und diente bei Ausbleiben eines Agonisten-induzierten
Kalzium-Signals als Positiv-Kontrolle.
4.10.2 Astrozytoma 1321N1 Zelllinie mit stabil exprimierenden P2Y1-VSV-C -Rezeptoren
Zunächst wurde getestet, ob die den Rezeptor P2Y1-VSV-C stabil exprimierenden Zellen nach
Stimulation mit ADP oder ATP eine Kalzium-Antwort liefern.
ratio (340/380)
5000
4000
3000
2000
1000
0
0 50 100
t [s]
150 200
Abb. 34: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma 1321 N1 mit
stabil exprimierenden P2Y1-VSV-C –
Rezeptoren. Zugabe von 5 µM ADP nach
45 s, 5 µM ATP nach 140 s. Jede Kurve mit
unterschiedlichem Symbol repräsentiert das
Kalziumsignal einer einzelnen Zelle.
ADP in einer Konzentration von 5 µM zeigte den erwarteten Kalzium-Anstieg in den Zellen.
Überraschenderweise zeigte auch ATP in einer Konzentration von 5 µM ein deutliches Kalzium-
Signal. Damit zeigt sich hier bereits eine erste Auffälligkeit in der Pharmakologie des P2Y1-
Rezeptors, und zwar in Abhängigkeit von der exprimierenden Zelle: In Thrombozyten kann nämlich
durch ATP keine Kalzium-Freisetzung bewirkt werden, während in Astrocytoma-Zellen eine
regelmäßige Kalzium-Antwort erfolgt.
Die variable Höhe des gemessenen Signals ist nicht auf eine unterschiedliche Expression der
Rezeptoren in den Zellen zurückzuführen, da mittels nachfolgender Immunfluoreszenz-Kontrollen
der vermessenen Zellen nachgewiesen werden konnte, daß alle Zellen identische
Expressionsmuster zeigen, wie ja von einer stabil exprimierenden Zelllinie nach klonaler Expansion
gefordert wird. Die dennoch auftretende Varianz ist somit auf eine unterschiedliche Beladung der
Zellen mit Fura-2 zurückzuführen, was durch unterschiedliche Fluoreszenzsignale der mit Fura-2
beladenen Zellen bestätigt werden konnte.
75

Zur weiteren Charakterisierung des pharmakologischen Profils des P2Y1-VSV-C in 1321N1 Zellen
wurden die bisher von Thrombozyten als selektiv bekannten Agonisten 2’-deoxy-ADP und 1-Methyl-
ADP eingesetzt.
ratio (340/380)
2500
2000
1500
1000
500
0
0 50 100 150
t [s]
200 250 300
Abb. 35: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden P2Y1-
VSV-C -Rezeptoren. Zugabe von 5 µM d-
ADP nach 45 s, 5 µM 1-Me-ADP nach 180
s. Jede Kurve mit unterschiedlichem
Symbol repräsentiert das Kalziumsignal
einer einzelnen Zelle.
In der folgenden Abbildung werden exemplarisch für den oben abgebildeten Stimulationsversuch
die vom Computer errechneten Orginaldaten für 340 nm und 380 nm sowie den in den Graphen
dargestellten Quotienten aus den beiden Messwerten (= ratio (340/380)) gezeigt.
76

340 nm
10 s 60 s 100 s 160 s 190 s 295 s
380 nm
10 s 60 s 100 s 160 s 190 s 295 s
ratio
10 s 60 s 100 s 160 s 190 s 295 s
Abb. 36: Visuelle Bildgebung der Stimulation einzelner Astrocytoma 1321N1 Zellen mit stabiler Expression des P2Y1-VSV-C nach Stimulation
mit 5µM d-ADP nach 45 s und 5µM 1-Me-ADP nach 180 s. Obere Reihe: Anregung mit 340 nm; mittlere Reihe: Anregung mit 380 nm; untere
Reihe: Quotient der Signale 340 nm/ 380 nm
77

Das Ergebnis zeigt ein deutliches Kalzium-Signal nach Zugabe von sowohl d-ADP als auch 1-Me-
ADP, das tendenziell etwas schwächer ausfällt als bei Zugabe von d-ADP. Dies konnte allerdigs
nicht nach Umkehrung der Pipettier-Reihenfolge gezeigt werden (Abb. nicht gezeigt), so daß die
Abschwächung des zweiten Signals wohl auf die Erschöpfung der Kalzium-Speicher der Zelle nach
vorangegangener maximaler Stimulation zurückzuführen ist.
Insgesamt zeigen die Rezeptoren allerdings eine nur geringe Neigung zur Desensitierung: In
diesen Versuchen, die eine Beobachtung der Zellen über einen maximalen Zeitraum von 5 Minuten
zulassen, konnte gezeigt werden, daß das Kalzium-Signal kann auch bei wiederholter Stimulation
immer wieder und auch in einer annähernd gleichen Intensität ausgelöst werden kann.
4.10.3 Astrozytoma 1321N1 Zelllinie mit stabil exprimierenden P2Y1-nat -Rezeptoren
Da die reklonierten Zelllinien, die den nativen P2Y1 Rezeptor ohne jeglichen Tag (P2Y1-nat)
exprimieren, erst nach Etablierung des Kalzium-Einzelzell-Messsystems ausgetestet werden
konnten, mußte zunächst gezeigt werden, daß auch diese Zellininen auf ADP und andere
Stimulantien hin ein Kalzium-Signal liefern. Weiterhin mußte im Vergleich mit den mit dem VSV-C-
Tag fusionierten P2Y1 Rezeptoren auf etwaige Unterschiede in der Pharmakologie oder der
Intensität gesucht werden.
ratio (340/380)
4000
3000
2000
1000
0
0 50 100 150
t [s]
200 250 300
Abb. 37: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma 1321 N1
mit stabil exprimierenden P2Y1-nat-
Rezeptoren. Zugabe von 5 µM ADP nach
30 s, 5 µM ATP nach 190 s. Jede Kurve
mit unterschiedlichem Symbol
repräsentiert das Kalziumsignal einer
einzelnen Zelle.
Die repräsentative Abbildung belegt, daß diese Zelllinien das erwartete identische Antwortverhalten
der oben gezeigten P2Y1-VSV-C exprimierenden Zellen zeigen. Darüberhinaus kann im Vergleich
mit den getaggten Rezeptoren keinerlei Unterschied im Verhalten der Zelllinien erkannt werden:
Sowohl die Intensitäten als auch die Charakteristiken der Kalziumsignale zeigen identische
Eigenschaften.
78

Zusammenfassend ergab sich folgendes Profil:
Substanz P2Y1-VSV-C in
1321N1-Zellen
P2Y1-nat in
1321N1-Zellen
ADP + + +
ATP + + -
d-ADP + + +
1-Me-ADP + + +
2-Cl-ADP + + +
αβmeATP - - -
P2Y1 in humanen
Thrombozyten
Tab. 5: Pharmakologisches Profil des P2Y1 in den Zelllinien sowie auf humanen Thrombozyten.
4.10.4 P2X1-C-Flag Kalzium-Einzelzellmessungs-Ergebnisse
Zunächst wurde entsprechend den obigen P2Y1-Zelllinien getestet, ob die den Rezeptor P2X1-C-
Flag stabil exprimierenden Zellen nach Stimulation mit ADP oder ATP eine Kalzium-Antwort liefern.
ratio (340/380)
4000
3000
2000
1000
0
0 50 100
t [s]
150 200
Abb. 38: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden
P2X1-C-Flag-Rezeptoren. Zugabe von
5 µM ADP nach 30 s, 5 µM ATP nach
90 s. Jede Kurve mit unterschiedlichem
Symbol repräsentiert das Kalziumsignal
einer einzelnen Zelle.
ADP in einer Konzentration von 5 µM zeigte den erwarteten Kalzium-Anstieg in den Zellen. Auch
mit ATP in einer Konzentration von 5 µM konnte ein deutliches Kalzium-Signal ausgelöst werden.
Diese deutliche ATP-Antwort stimmt zwar nicht mit dem Verhalten des P2X1 Rezeptors in humanen
Thrombozyten überein, wurde jedoch von einigen anderen Arbeitsgruppen bereits berichtet
(153;154).
79

Da der Rezeptor P2X1 strukturell ein Kalzium-Kanal ist, ist der Anstieg des Signals steiler, da der
Einstrom von extrazellulärem Kalzium schneller stattfindet als die Freisetzung von Kalzium aus den
intrazellulären Speichern, wie im Fall des Gq-gekoppelten Rezeptors P2Y1.
Zur weiteren Charakterisierung des pharmakologischen Profils des P2X1 in 1321N1 Zellen wurden
der bekannte selektive Agonist αβ-methyl-ATP eingesetzt und auch die Intensität des Kalzium-
Signales mit der des ADP-Signales verglichen.
ratio (340/380)
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0 50 100 150
t [s]
200 250 300
Abb. 39: Kalzium-Einzelzell-Meß-Ergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma 1321 N1
mit stabil exprimierenden P2Y1-VSV-C -
Rezeptoren. Zugabe von 5 µM αβmeATP
nach 30 s, 5 µM ADP nach 210 s. Jede
Kurve mit unterschiedlichem Symbol
repräsentiert das Kalziumsignal einer
einzelnen Zelle.
Hier zeigt sich das aus den Thrombozyten bekannte Kalzium-Antwortverhalten auch bei den stabil
den P2X1-C-Flag exprimierenden Astrozytoma-Zellen: αβmeATP ist in der Lage, deutliche Kalzium-
Signale –mindestens in der Höhe des jeweiligen ADP-Kontroll-Signales auszulösen. Dies zeigte
sich auch nach Umkehrung der Pippetierreihenfolge.
Zusammenfassend ergab sich folgendes Profil:
Substanz P2X1-C-FLAG in
1321N1-Zellen
ADP + +
ATP + +
d-ADP - -
1-Me-ADP - -
2-Cl-ADP + +
αβmeATP + +
P2X1 in humanen
Thrombozyten
Tab. 6: Pharmakologisches Profil des P2X1 in den Zelllinien sowie auf humanen Thrombozyten.
80

4.10.5 Versuche zur Regulation des P2Y1-Rezeptors in Astrozytoma 1321N1 Zellen
4.10.5.1 Versuche zu einer möglichen Regulation des P2Y1 Rezeptors durch eine Aktivierung
der cGMP-abhängigen Proteinkinase (G-Kinase)
Aus Experimenten mit Thrombozyten ist bekannt, daß nach Zugabe von Stickstoffmonoxid (NO) via
Stimulation der Guanylylcyclase und konsekutiver Erhöhung der cGMP-Spiegel - vermutlich über
eine Phosphorylierung durch die G-Kinase - eine Inhibierung der Kalzium-Freisetzung auftritt. Der
genaue Mechanismus ist ungeklärt. Daher stellt ein System, in dem der Rezeptor einer
Untersuchung besser zugänglich ist als in den in ihrer Lebenszeit sehr begrenzten Thrombozyten,
eine ausgezeichnete Möglichkeit zur genaueren Charakterisierung der intrazellulären Signalwege
dar.
Da ein die G-Kinase enthaltender viraler Vektor zur Verfügung stand, wurde auf eine Bestimmung
der endogenen G-Kinase verzichtet (146).
Ebenfalls zur Verfügung stand ein viraler Vektor, der eine nicht funktionsfähige G-Kinase exprimiert.
Dieser diente als Kontrolle für eventuell auftretenden Artefakte durch die virale Infektion der Zellen
(146).
Die Effektivität der viralen Transfektion wurde mittels Immunfluoreszenz direkt von den in den
Messungen verwendeten Glasplättchen überprüft und lag bei fast 100%, so daß davon
ausgegangen werden kann, daß alle vermessenen Zellen auch die G-Kinase exprimierten.
Als direkter Aktivator der G-Kinase wurde 8-(p-Chlorophenylthio)-cGMP (8-pCPT-cGMP) eingesetzt
(15).
81

atio (340/380)
ratio (340/380)
ratio (340/380)
4000
3000
2000
1000
4000
3000
2000
1000
4000
3000
2000
1000
0
0 50 100 150 200 250
t [s]
0
0 50 100 150 200 250
t [s]
0
0 50 100 150
t [s]
200 250 300
Abb. 40: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden P2Y1nat-Rezeptoren.
Die Zellen wurden
zusätzlich mit der nicht funktionsfähigen
G-Kinase transfeziert. Zugabe von 500 µM
8-pCPT-cGMP 10 Minuten vor Start der
Messung, dann Zugabe von 5 µM ADP
nach 30 s.
Abb. 41: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden P2Y1nat-Rezeptoren.
Die Zellen wurden
zusätzlich mit der funktionsfähigen G-
Kinase transfeziert. Zugabe von 500 µM 8pCPT-cGMP
10 min vor Start der
Messung, dann Zugabe von 5 µM ADP
nach 30 s.
Abb. 42: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden P2Y1nat-Rezeptoren.
Die Zellen wurden
zusätzlich mit der funktionsfähigen G-
Kinase transfeziert. Zugabe von Zugabe
von 5 µM ADP nach 30 s und 0,5 U
Thrombin nach 160 s.
Sowohl in den Zellen, die eine funktionsunfähige G-Kinase exprimieren, als auch in denen, die eine
funktionsfähige G-Kinase exprimieren, konnten Kalzium-Signale nach Inkubation mit 8-pCPT-cGMP
82

gemessen werden, die in ihrer Größe den Signalen der Kontrollmessung entsprachen. Daraus
lassen sich folgende Schlußfolgerungen ableiten:
Die Transfektion der Zellen mit viralen Vektoren beeinträchtigt die Messungen nicht.
Die Inkubation der Zellen mit 8-pCPT-cGMP beeinträchtigt die Messungen ebenfalls nicht.
Die G-Kinase kann in dem System der den P2Y1-Rezeptor heterolog exprimierenden Astrozytoma
Zelllinie 1321 N1 keinen Einfluß auf die Funktion des Rezeptors nehmen, insbesondere kann sie
nicht – wie in Thrombozyten bekannt – das Kalzium-Signal nach Stimulation des P2Y1 durch ADP
inhibieren.
4.10.5.2 Versuche zu einer möglichen Regulation des P2Y1 Rezeptors durch eine Aktivierung
der cAMP-abhängigen Proteinkinase (A-Kinase)
Aus Experimenten mit Thrombozyten ist ebenfalls bekannt, daß nach Zugabe von PG-E1 via
Stimulation der Adenylylcyclase und konsekutiver Erhöhung der cAMP-Spiegel und damit einer
Aktivierung der A-Kinase - eventuell über eine direkte Phosphorylierung - eine Inhibierung der
Kalzium-Freisetzung auftritt. Der genaue Mechanismus ist auch hier ungeklärt.
Die A-Kinase ist in den meisten Zellen exprimiert, und auch die Astrocytoma Zelllinie verfügt über
eine endogen exprimierte PKA, welche durch PG-E1 akitviert werden kann, da erhöhte cAMP-
Spiegel nach PG-E1-Stimulation mittels RIA nachgewiesen werden konnten (Daten nicht gezeigt).
Ebenso konnte nach PG-E1-Stimulation eine VASP-Phosphorylierung mittels Western-Blot gezeigt
werden (Daten ebenfalls nicht gezeigt).
83

atio (340/380)
ratio (340/380)
4000
3000
2000
1000
4000
3000
2000
1000
0
0 50 100 150
t [s]
200 250 300
0
0 50 100 150
t [s]
200 250 300
Abb. 43: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden P2Y1nat-Rezeptoren.
Zugabe von 0,5 µM PG-
E1 30 s nach Start der Messung, dann
Zugabe von 5 µM ADP nach 120 s.
Abb. 44: Kalzium-Einzelzell-Meßergebnisse
an der Zelllinie Astrozytoma
1321 N1 mit stabil exprimierenden P2Y1nat-Rezeptoren.
Zugabe von 5 µM ADP
nach 120 s.
Nach Zugabe von PG-E1 ist weiterhin Kalzium-Freisetzung in den Zellen auslösbar. Da aufgrund
zeitlicher Limitationen diese Versuche für eine statistische Auswertung nicht häufig genug
durchgeführt werden konnten, bleibt nur der Hinweis auf einen möglichen Trend hin zu geringenen
Kalzium-Signalen nach PG-E1-Stimulation.
Damit lassen sich folgende Schlußfolgerungen ableiten:
Die Inkubation der Zellen mit PG-E1 oder Forskolin beeinträchtigt die Messungen nicht.
Die A-Kinase kann in dem System der den P2Y1-Rezeptor heterolog exprimierenden Astrozytoma
Zelllinie 1321 N1 zwar keinen Einfluß auf die prinzipielle Funktion des Rezeptors nehmen,
allerdings ist ein Beeinflussung hin zu einer leichten Hemmung in der gewählten PG-E1-
Konzentration tendenziell zu beobachten.
84

5. Diskussion
5.1 Studiendesign
Das Design der Studien, die im Zeitraum vom November 1996 bis Mai 1997 durchgeführt wurden,
beruht auf dem damaligen Stand der Forschung. Als große Neuerung galt die Postulierung eines
Drei-Rezeptoren-Modells für die ADP-induzierte Aggregation: Dieses besagt, daß 3 verschiedene
ADP-Rezeptoren die ADP-Antwort in humanen Thrombozyten vermitteln, nämlich der P2Y1-
Rezeptor, der P2X1-Rezeptor sowie der damals noch nicht molekular identifizierte P2Y12, zu
dieser Zeit vorläufig mit P2Yac bezeichnet (vgl. Einleitung).
Anhand Abb. 1 wird veranschaulicht, daß das Design der Studien versucht, die Wirkung von
Thienopyridine, die bis dahin lediglich als „ADP-Rezeptor-Antagonisten“ gehandelt wurden, im
Zusammenhang mit diesem neuen Modell näher zu charakterisieren, und zwar insbesondere die
Fragestellung, welche/r dieser 3 Rezeptoren nun tatsächlich durch die Thienopyridine beeinflußt
wird/werden. Weiterhin sollte geprüft werden, ob durch eine mögliche Veränderung des
Phosphorylierungsstatus des Proteins VASP ein Hinweis auf die möglichen intrazellulären
Konsequenzen der Thienopyridine gefunden werden kann.
Zusammenfassend sollte untersucht werden:
- Wie zuverlässig wirksam sind die Substanzen, und in welchem Ausmaß unterscheidet sich die
individuelle Wirksamkeit? Zur Beantwortung dieser Fragen wird die Aggregation der Thrombozyten
der Probanden beurteilt, da die Aggregation als Endereignis der Aktivierung die Integration einer
ganzen Reihe von Signalwegen in den Thrombozyten beinhaltet und einen sehr gut bestimmbaren
und sicher reproduzierbaren Parameter darstellt.
- Beeinträchtigen die Substanzen den Rezeptor P2X1? Diese Frage kann durch die Interpretation
der Kalzium-Messungen beantwortet werden, und zwar des Kalzium-Einstroms in Thrombozyten.
- Beeinträchtigen die Substanzen den Rezeptor P2Y1? Diese Frage kann ebenfalls durch die
Interpretation der Kalzium-Messungen, hier durch die Bestimmung der Kalzium-Freisetzung in den
Thrombozyten beantwortet werden.
- Beeinträchtigen die Substanzen den Rezeptor P2Yac/12? Diese Frage kann mittels zwei
verschiedener Methoden beurteilt werden: Einmal durch Bestimmung der cAMP-Spiegel in den
Thrombozyten, und zusätzlich durch Bestimmung des Phosphorylierungsstatus des Proteins VASP,
der durch die von cAMP-Spiegeln abhängige Proteinkinase A reguliert wird.
- Kann eine direkte Veränderung des Phosphorylierungsstatus von VASP detektiert werden? Über
die oben bereits genannte Funktion als Parameter für die Beeinflussung des P2Yac/12 Rezeptors
85

hinaus hat VASP, insbesondere phosphoryliertes VASP, auch wichtige Funktionen in der
Hemmung der Thrombozyten. Dies könnte einen Teil der Wirkung des Clopidogrels erklären.
5.2 Aggregation als Parameter der Wirksamkeit
Die ADP-induzierte Aggregation diente als Parameter der Wirksamkeit der Substanzen. Nach 7tägiger
Einnahme der üblichen klinischen Dosen von entweder Ticlopidin oder Clopidogrel konnte
gezeigt werden, daß die ADP-induzierte Aggregation auf ca. 10% des Ursprungswertes bzw. ca. 6
% im Falle des Clopidogrels abgefallen war. Damit konnte die ausgezeichnete Wirksamkeit der
beiden Substanzen gezeigt werden. Der in der Ticlopidin-Studie erstellte Zeitverlauf zeigt, daß die
Wirkung nach 3-4 Tagen einsetzt noch 2 Tage nach Absetzten voll erhalten bleibt, dann aber
innerhalb von 5 Tagen deutlich abnimmt. Nach schließlich ca. einer weiteren Woche ist die ADPinduzierte
Aggregation wieder auf dem Ausgangsniveau, da die mit Ticlopidin „behandelten“
Thrombozyten innerhalb von ca. 10 Tagen durch neu gebildete, voll funktionsfähige Thrombozyten
ersetzt werden. Dies bestätigt die Irreversibilität der Wirkung der Substanz. Die Daten des
Zeitverlaufes sind mit hoher Wahrscheinlichkeit übertragbar auf Clopidogrel, das ähnlich
verstoffwechselt wird (133). Um die Latenz bis zum vollen Wirkeintritt zu verkürzen, kann beim
Clopidogrel eine sogenannte loading dose von 300 mg am ersten Tag der Einnahme verabreicht
werden (56).
Die Versuche zur Beeinflussung des Synergismus von niedrigmolarem ADP mit Epinephrin zeigen,
daß auch dieser Synergismus, dessen biochemischer Ursprung nicht völlig geklärt ist, Clopidogrelsensitiv
ist. Dies könnte ein weiterer Beitrag zur ausgezeichneten Wirksamkeit des Clopidogrels
sein (18).
Bei genauerem Betrachten der individuellen Kurven, auch der mit 2,5 µM ADP, fällt auf, daß der
kurze negative Ausschlag der vom Aggregometer aufgezeichneten Kurven bei allen Probanden
auch während der Zeit der Substanzen-Einnahme erhalten blieb. Dieser Ausschlag, der den shape
change repräsentiert, wird also durch die Thienopyridine nicht beeinflußt und gibt damit einen
ersten Hinweis darauf, daß der damit in Verbindung zu bringende P2Y1 Rezeptor nicht durch die
Substanzen beeinträchtigt wird.
Ein überraschender Punkt der Clopidogrel-Studie war das Auftreten eines Non-Responders. Auch
wenn die Größe der Studie (6 Probanden, davon ein Non-Responder) sicherlich keinen Rückschluß
auf die Häufigkeit von Non-Respondern bei der Behandlung mit Clopidogrel zuläßt, muß doch die
Frage nach der Häufigkeit solcher Ereignisse gestellt werden.
Da Clopidogrel durch hepatische Metabolisierung aktiviert werden muß (131), ist eine kompetetive
Inhibierung gut denkbar. Tatsächlich ergaben sich Hinweise auf einen solchen kompetitiven Effekt
im Falle des Atorvastatins, einem Lipidsenker der Statin-Klasse (22;82). Da diese Medikamente wie
86

auch andere bei Patienten mit Atherosklerose häufig in Kombination gegeben werden, ist hier ein
Screening nach Wirksamkeit des Clopidogrels besonders wünschenswert.
Eine weitere Möglichkeit für eine Resistenz könnte eine Veränderung des P2Y12-Rezeptors
darstellen, z.B. im Sinne einer Mutation der Bindungsstelle des aktiven Clopidogrel-Metaboliten.
Daten zu einer solchen, schwierig zu entdeckenden Mutation liegen bisher nicht vor.
Bislang existieren noch keine zuverlässigen Studien über die Häufigkeit von Therapieversagern bei
Thienopyridinen. Sie werden bisher nur klinisch definiert: Patienten, bei denen trotz Einnahme von
Ticlopidin oder Clopidogrel nach initialem Herzinfarkt, Schlaganfall oder peripherem
Arterienverschluß ein Zweitereignis auftritt, werden als Non-Responder bezeichnet und auf einen
Thrombozytenaggregationshemmer einer anderen Substanzklasse umgestellt. Dieses Vorgehen ist
unbefriedigend, so daß die Möglichkeit eines sogennanten „Drug-Monitorings“ äußerst
wünschenswert wäre. Die Messung der ADP-induzierten Aggregation bei Patienten, die ein
Thienopyridin einnehmen, könnte einen solchen Zweck erfüllen. Leider sind
Aggregationsmessungen aufgrund des relativ hohen Aufwandes, ausgeprägter Variabilität und
fehlender Standardisierung flächendeckend kaum einsetzbar, so daß dieser Assay bisher nur
größern Zentren vorbehalten bleibt. Später in dieser Diskussion wird diese Frage anhand der
VASP-Phosphorylierung nochmals aufgegriffen.
5.3 Beeinflussung des P2X1
Der P2X1 ist ein ligandengesteuerter Kationenkanal, der zum sofortigen Einstrom von Kalzium aus
dem Extrazellulärraum führt. Die Bestimmung des schnellen Kalzium-Einstroms in Thrombozyten in
Gegenwart von extrazellulärem Kalzium repräsentiert also den Anteil des P2X1 an der Änderung
der Kalziumkonzentration in den Plättchen. In den Studien konnte keinerlei Unterschied im ADPvermittelten
Kalziumeinstrom in die Thrombozyten vor, während oder nach der Behandlung mit
entweder Ticlopidin oder Clopidogrel gezeigt werden. Die Rolle des P2X1 in der ADP-induzierten
Aggregation ist noch immer nicht klar. Da man durch alleinige Stimulation des P2X1 nicht bzw.
durch ausschließliche Stimulation der beiden anderen ADP-Rezeptoren eine Aggregation auslösen
kann, wird er von verschiedenen Arbeitsgruppen als nicht essentiell für eine ADP-vermittelte
Aggregation gehalten (149). Allerdings konnte Rolf et al. (120) zeigen, daß der P2X1 alleine auch
einen shape change in den Plättchen auslösen kann. Inzwischen existiert auch ein Maus-Modell, in
dem der P2X1 deletiert wurde (97). Die vorliegenden Daten zu den Versuchen mit murinen
Megakaryoztyen beschreiben einen bahnenden Effekt des P2X1 – in seiner Abwesenheit fällt die
Antwort der P2Y-Rezeptoren schwächer aus und beginnt später (157). Unterstützt wird diese
Hypothese durch andere Arbeitsgruppen, die mittels Überexpression (106) oder pharmakologisch
(121) eine insgesamt fördernde Wirkung des P2X1 auf die Plättchenaggregation beschreiben, ohne
87

daß eine alleinige oder Ko-Stimulation mit einem der beiden anderen ADP-Rezeptoren eine
Aggregation auslösen kann. Ein weiterer Hinweis kommt durch die Entdeckung einer dominant
negativen Mutation in einem Patienten mit einer starken Blutungsneigung, was ebenfalls den proaggregatorischen
Effekt des P2X1 unterstreicht (107). Vermittelt werden könnten solche Effekte
durch eine Modulation des Zytoskeletts, die eine Aktivierung der Thrombozyten begünstigten
könnte (109).
5.4 Beeinflussung des P2Y1
Der P2Y1 ist ein Sieben-Transmembran-Rezeptor, der im Zellinneren an ein Gq-Protein koppelt,
wodurch es nach PLC-Aktivierung schließlich zu einer IP3-vermittelten Freisetzung von Kalzium aus
intrazellulären Speichern kommt. Die Aktivierung dieser Signalkaskade konnte durch Bestimmung
der Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration in Gegenwart von extrazellulärem EGTA
gemessen werden. Ähnlich dem schnellen, P2X1-vermittelten Kalziumeinstrom konnte auch bei der
Kalzium-Freisetzung keinerlei Unterschied vor, während oder nach der Gabe der Thienopyridine
gemessen werden. Auch dies ist übereinstimmend inzwischen von verschiedenen Gruppen
berichtet worden (64;132). Wie oben bei der Aggregation bereits erwähnt, ist der shape change
auch während der Einnahme der Substanzen bei allen Probanden nachweisbar. Das
Zustandekommen dieses shape changes ist auf biochemischer Ebene eng verknüpft mit dem P2Y1
(104;110;163), was einer weiterer Beleg dafür ist, daß er nicht von den Thienopyridinen beeinflusst
wird. Dies konnte weiterhin eindrucksvoll unterlegt werden durch die Etablierung eines Maus-
Modells mit fehlendem P2Y1 Rezeptor: Die Thrombozyten dieser Mäuse zeigen keinen shape
change, eine vermindete Aggragationfähigkeit, die Tiere haben verlängerte Blutungszeiten und
bilden kaum Thromben (38;83).
5.5 Beeinflussung des P2Yac/12
Unter der Gabe von Ticlopidin oder Clopidogrel war ADP nicht mehr in der Lage, den durch PG-E1
verursachten Anstieg des cAMP-Spiegels zu blockieren. Weiterhin konnte ADP auch nicht mehr die
Phosphorylierung des Zytoskelett-assozierten Proteins VASP durch die cAMP-abhängige
Proteinkinase nach PG-E1 Stimulation blockieren. Dies läßt darauf schließen, daß entweder die
Blockade eines an einen Gi-Protein gekoppelten Rezeptors oder die Blockade des Gi-Proteins
selbst die Ursache dafür ist. Die Tatsache, daß Epinephrin weiterhin in der Lage ist, durch das an
seinen α2-Rezeptor gekoppelte Gi-Protein die PG-E1-vermittelte cAMP-Erhöhung bzw. die
nachfolgende VASP-Phosphorylierung zu blockieren, zeigt, daß nicht das Gi-Protein in seiner
Funktion beeinträchtigt ist, sondern vielmehr der vorgeschaltete Rezeptor. Ob diese
Funktionsbeeinträchtigung nun am extrazellulären Teil des Rezeptors stattfindet, z.B. durch eine
88

Blockade der Bindungsstelle für das ADP bzw. eine sterische Konformationsänderung des
Rezeptors, oder am intrazellulären Teil des Rezeptors, was zu einer Entkopplung des Rezeptors
von seinem G-Protein führen würde, ist allerdings hier nicht zu klären.
Inzwischen gibt es Hinweise darauf, daß der aktive Metabolit des Clopidgrels eine reaktive
Thiolgruppe besitzt, welche wiederum mit einem Zystein des P2Y12 eine Disulfid-Brücke bilden
könnte und den Rezeptor damit inaktivieren könnte (133). Von den drei bisher bekannten ADP-
Rezeptoren auf humanen Thrombozyten ist nur der P2Y12 an ein Gi-Protein gekoppelt. Dadurch
ergibt sich eine erstaunliche Spezifität für die Thienopyridine, die sehr selektiv nur den P2Y12 in
seiner Funktion beeinträchtigen, ohne die restlichen ADP-Rezeptoren bzw. die anderen Plättchen-
Rezeptoren zu beeinflussen.
Unterstützt werden diese Ergebnisse von Experimenten mit Mäusen, die eine Deletion des P2Y12-
Genes aufweisen: Ihre Thrombozyten zeigen eine um etwa 75% reduzierte Aggregation mit ADP,
welche bei einer Gabe von Clopidogrel dann auch nicht mehr weiter vermindert werden kann (41).
5.6 Beeinflussung des Phosphorylierungsstatus von VASP
Neben der bereits oben erwähnten Indikator-Funktion für erhöhte cAMP-Spiegel und damit
verknüpften erhöhten Aktivität der Proteinkinase A ist die Phosphorylierung des Proteins VASP
auch von entscheidender Bedeutung für den Aktivierungszustand der Thrombozyten. In einer
wegweisenden Arbeit konnten Horstrup et al. 1994 (70) zeigen, daß der Phosphorylierungsstatus
von VASP sehr eng mit der Hemmung des Fibrinogenrezeptors, dem Glykoprotein IIb/IIIa,
korreliert. Diese Phosphorylierung wird physiologisch durch die Abgabe von cAMP-erhöhenden
Substanzen wie Prostacyclin oder cGMP-erhöhenden Substanzen wie NO aus dem intakten
Endothel vermittelt (100;112). Weitere Hinweise auf die inhibitorische Wirkung von VASP auf die
Plättchen-Aktivierung/-Aggregation entstammen den Daten der Analyse von VASP-defizienten
Mäusen (vgl. Einleitung). Daher könnte ein wichtiger Teil der Wirkung der Thienopyridine darin
bestehen, die ADP-vermittelte Senkung des Phospo-VASP-Anteils zu blockieren und über eine
Anhebung des phosphorylierten Anteils von VASP den Aktivierungszustand der Plättchen verstärkt
in die Richtung einer Hemmung oder zumindest einer erschwerten Aktivierung zu verschieben.
5.7 Zusammenfassung / Ausblick
Zwischenzeitlich konnte klar gezeigt werden, daß für eine vollständige und irreversible Aggregation
eine gleichzeitige Stimulation von Gq (gekoppelt entweder an einen P2Y1-, Thromboxan-,
Serotonin- oder Thrombin- Rezeptor) und von einem Gi-Protein (gekoppelt an entweder einen
P2Y12-, Thrombin- oder Epinephrin-Rezeptor) essentiell ist (vgl. Einleitung).
89

Zusammenfassend kann man die Rolle der einzelnen ADP-Rezeptoren heute so beschreiben: Die
Rolle des P2X1 bleibt weiter unklar, eine mögliche Funktion liegt in einem Beitrag zum shape
change. Der P2Y1 ist verantwortlich für den ADP-induzierten shape change und außerdem in der
Lage, selbständig eine reversible ADP-induzierte Aggregation auszulösen. Der P2Y12 dient
schließlich der Verstärkung der durch den P2Y1 eingeleiteten Aggregation und überführt diese in
eine irreversible Aggregation.
In der Zusammenschau dieser aktuellen Ergebnisse kann klar die Übereinstimmung mit den
Ergebnissen dieser Arbeit gezeigt werden: Durch die selektive Blockade des P2Y12 durch die
Thienopyridine wurde eine ADP-induzierte Aggregation in den Thrombozyten der Probanden
deutlich vermindert. Die gute Wirksamkeit der Substanzen ist also trotz ihrer erstaunlichen
Selektivität damit erklärbar. Durch die gezeigte Aufhebung des klassischen Synergismus von
niedrigmolaren Mengen an ADP und Epinephrin wird ein weiterer potentiell wichtiger Mechanismus
der Plättchenaktivierung inhibiert. Die Aufhebung der ADP-vermittelten Blockierung der VASP-
Phosphorylierung könnte eine wichtige intrazelluläre Konsequenz einer Behandlung mit
Thienopyridinen darstellen.
Diese Mechanismen tragen auch bei bereits teilweise vorhandener endothelialer Dysfunktion durch
Atherosklerose mittels einer Verstärkung noch vorhandener hemmender Wirkung endothelialer
Faktoren auf die Aktivierung der Thrombozyten bei, was klinisch durch zwischenzeitlich
verschiedene Studien an großen Patientenkollektiven auch eindrücklich gezeigt werden kann.
Wo also liegt der aktuelle klinische Anwendungsbereich des Clopidogrels? Aufgrund der – wenn
auch kleinen – statistischen Überlegenheit gegenüber dem ASS kann Clopidogrel prinzipiell bei
allen Indikationen für einen Thrombozytenaggregationshemmer eingesetzt werden (18). Bei
allerdings noch immer immensem Preisnachteil gegenüber dem ASS kommt es im klinischen Alltag
zu folgenden Einschänkungen der Anwendung:
Seine Hauptanwendung hat Clopidogrel bei Patienten, die einer Thrombozytenhemmung bedürfen,
und gleichzeitig eine oder mehrere Kontraindikationen gegen ASS aufweisen oder eine ASS-
Unverträglichkeit zeigen.
Weiterhin wird es bei Patienten eingesetzt, die unter einer Thrombozytenaggregationshemmung mit
ASS ein Zweitereignis zeigen, also bei klinisch definierten ASS-Non-Respondern.
Durch Metaanalysen der CAPRIE-Studie konnten für Schlaganfallpatienten diverse Untergruppen
ausfindig gemacht werden, die von einer Clopidogrel-Gabe besonders profitieren: Patienten mit
insulinpflichtigem Diabetes (9), anamnestisch bekanntem koronarem Bypass (8) sowie Patienten
mit zerebraler Ischämie mit gleichzeitig bestehenden begleitenden sonstigen Gefäßerkrankungen
(KHK, Herzinfarkt, pAVK) (37). Bei diesen Gruppen sollte ein primärer Einsatz von Clopidogrel
zumindest diskutiert werden.
90

Aufgrund des zum ASS divergenten Wirkmechanismus stellt sich die Frage der Kombination der
beiden Thrombozytenaggregationshemmer: Während der kurzfristige Einsatz dieser Kombination
z.B. vor bzw. nach Stentimplantation nach erfolgreichem Studienabschluß (CURE (93)) heute
bereits klinisch angewandt wird, kann der langfristige Einsatz zur Sekundärprophylaxe nach einer
zerebralen Ischämie erst nach Auswertung der MATCH-Studie in Betracht gezogen werden, da sich
hier ein erhöhtes Nebenwirkungsrisiko, insbesondere das von intrakraniellen Blutungen, besonders
negativ auswirken könnte. Erste Hinweise dieser Studie sind allerdings vielversprechend.
Als letzter Punkt soll hier nochmals kurz die Frage nach der Erkennung von möglichen Non-
Respondern diskutiert werden. Die klinische Definition diese Patientengruppe wird erst nach der
darausfolgenden Konsequenz, nämlich dem Auftreten eines Ereignisses unter der Gabe eines
Thrombozytenaggregationshemmers, gestellt. Dieser für den Patienten als auch für den klinisch
tätigen Arzt sicherlich unbefriedigende Ansatz sollte – auch angesichts einer vermutlich hohen Rate
an Non-Respondern – Anlaß zur Entwicklung von Strategien zur Erkennung der Non-Responder
geben.
Für das Screening nach ASS-Non-Respondern steht zwischenzeitlich mit dem PFA-100 ein
kommerziell erwerblicher automatisierter Assay zur Verfügung (90). Dieses Gerät mißt in
speziellen, mit Kollagen und Epinephrin bzw. Kollagen und ADP beschichteten Kapillaren eine
sogenannte closing time, die Zeit, die zum Verschluß der Kapillare vergeht (90;111). In ersten
Studien konnte ein Monitoring der ASS-Wirkung gezeigt werden (1;69;96;111;122). Inwieweit diese
erhobenen Daten mit der klinischen Definition des Non-Responders korrelieren, also der erhöhten
Rate an Zweitereignissen, muß in prospektiven Studien jedoch noch weiter geklärt werden (1;122).
Die Wichtigkeit dieser Studien wird durch neuere Ergebnisse von Schlaganfallpatienten belegt: Hier
konnten bis zu 40% der unter einer Sekundärprophylaxe mit ASS aufgetretenen Ereignisse mit
einem ASS-Non-Responder-Status korreliert werden (55).
Der PFA-100 ist leider nicht geeignet für die Detektion eines Effektes durch Clopidogrel geeignet
(96). Für das Screening von Clopidogrel-Non-Respondern könnten die hier vorgestellten Methoden
(Aggregationsmessung sowie RIA bzw. Western-Blot) eingesetzt werden. Leider sind diese zu
zeitaufwendig und kostenintensiv für den klinischen Alltag. Ein FACS-basiertes Verfahren zur
Messung der veränderten VASP-Phosphorylierung in Thrombozyten, das parallel zu der hier
vorgestellten Studie entwickelt wurde (139), könnte ein erster Ansatzpunkt sein. Das Protein VASP,
dessen Phophorylierungsstatus sich ausgezeichnet darstellen läßt (116;145) und das während
einer suffizienten Clopidogrel-Behandlung ja die oben beschriebenen Veränderungen aufweist,
wäre auch ein idealer Kandidat für die Entwicklung eines ELISA-basiertem Verfahren. In Anbetracht
91

der demnächst zu erwartenden Preisreduktion des Clopidogrels könnte somit für jeden Patienten
der für ihn optimale Thrombozytenaggregationshemmer gefunden werden. Somit könnte vermutlich
eine größere Anzahl von Zweitereignissen verhindert werden, so daß die leider häufig diskutierte
Frage nach den Kosten einer routinemäßigen Kontrolle vor dem Hintergrund der Vermeidung der
immensen Kosten der Zweitereignisse diskutiert werden sollte.
5.8 Klonierung der Rezeptoren / Plasmidkonstruktion
Um bessere Möglichkeiten zur Untersuchung der bereits bekannten und klonierten ADP-
Rezeptoren der humanen Thrombozyten zu schaffen, sollten für die beiden Rezeptoren P2X1 und
P2Y1 Zelllinien geschaffen werden, die diese Rezeptoren stabil exprimieren.
Sowohl die cDNA für den P2Y1 als auch die cDNA für den P2X1 wurden aus Thrombozyten-RNA
kloniert. Diese RNA wurde aus mehrfach gewaschenen und erneut konzentrierten
Thromozytenkonzentraten aus der Transfusionsmedizinischen Abteilung der Universitätsklinik
Würzburg gewonnen. Durch bereits etablierte Leukozytenmarker konnte eine Verunreinigung der
Plättchen-RNA mit Leukozyten-RNA ausgeschlossen werden (G.I. Kristjansson, nicht publiziert).
Damit konnte gezeigt werden, daß sowohl mRNA des P2Y1 als auch des P2X1 in voller Länge in
Thrombozyten vorliegt, was einen Rückschluß auf ihre Expression auf Thrombozyten nahelegt.
Da zum Zeitpunkt des Beginns der vorliegenden Arbeit keine Antikörper für die beiden Rezeptoren
vorlagen, sollten „getaggte“ Rezeptoren exprimiert werden. Der Tag ermöglicht den Einsatz gut
charakterisierter Antikörper zur Detektion der Rezeptoren, idealerweise ohne Beeinflussung der
Funktion der Rezeptoren (73). Insgesamt kamen 4 verscheidene Tags zum Einsatz, was eine gute
Kombinierbarkeit der Konstrukte ermöglicht. Nicht alle Tags allerdings erwiesen sich als neutral:
Der FLAG-Tag interferierte mit der Prozessierung des P2Y1 Rezeptors, so daß eine Expression an
der Zelloberfläche nicht nachweisbar war. Dies passiert wahrscheinlich auf Ebene des Golgi-
Apparates, da eine Translation mit Hilfe des in-vitro-Translationssystems gezeigt werden konnte
(siehe Abb. 25). Die anderen Tags zeigen unabhängig voneinander ein einheitliches
Expressionsmuster an der Zelloberfläche. Zur Kontrolle einer möglichen Beeinflussung durch einen
Tag wurde auch ein sogenannter „nativer” P2Y1 in einen Expressionvektor kloniert. Er diente bei
den funktionellen Kalzium-Messungen als Kontrolle.
5.9 Expression in Zellen
Für die Expression der Konstrukte standen verschiedene Zelllinien zur Verfügung: Die COS-7-Linie,
die HEK-239-Linie, die PTK-2-Linie sowie die 1321N1-Linie.
Während die 1321N1-Linie sich durch eine Abwesenheit von purinergen Rezeptoren auszeichnet
und somit sehr gut für funktionelle Untersuchungen der Rezeptoren geeignet ist, kennzeichnet die
92

anderen Zellininen eine sehr einfache Handhabung sowie eine weite Verbreitung in vielen Labors.
Experimente, bei denen die Konstrukte transient exprimiert wurden, wurden häufig mit COS-7
Zellen durchgeführt, die 1321N1-Zellen für die Etablierung stabiler Zelllinien und den damit
verbundenen funktionellen Untersuchungen benutzt.
5.9.1 Transiente Expression
Verschiedene Methoden wurden mittels transienter Expression etabliert: Der Nachweis mittels
Western-Blot bzw. Immunpräzipitation, der Nachweis mittels Immunfluoreszenz und der Nachweis
im FACS.
In einem Standard-Western-Blot-Ansatz zum Nachweis der exprimierten Rezeptoren ließ sich
zunächst der P2X1-Rezeptor problemlos mit seinen beiden Tags nachweisen. Die Größe der
Bande entsprach dabei der vorher kalkulierten Größe, und da inzwischen auch ein kommerziell
erwerblicher Antikörper erhältlich ist sowie publizierte Daten anderer Guppen vorliegen (54;148),
die gleiche Ergebnisse zeigen, kann bei der detekierten Bande von der P2X1-Bande gesprochen
werden.
Anders dagegen die Situation im Falle des P2Y1: Mit dem Standard-Western-Blot-Ansatz aus
Zelllysat ließ sich der Rezeptor unabhängig von den verschiedenen Tags niemals nachweisen. Erst
nach Konzentration der Rezeptoren durch eine Immunpräzipitation konnte eine Bande im
anschließenden Western-Blot detekiert werden. Das erhaltene Signal allerdings zeigt deutliche
Unterschiede zu der einzelnen P2X1-Bande: Neben einer deutlichen Bande bei ca. 45 kDA, die der
vorherbestimmten Größe des Rezeptors im SDS-Gel entspricht, zeigt sich von ca. 60 kDA an
aufwärts ein breiter „Schmier“, der wohl die unterschiedlich glykosylierten Varianten des P2Y1
repräsentiert. In der Tat besitzt der P2Y1 3 Glykosylierungsstellen (74), und die Arbeiten an
anderen 7-Transmenbran-Rezeptoren mit Glykosilierungsstellen haben gezeigt, daß tatsächlich ein
ähnliches Signal auftritt (57). Bisher ist bemerkenswerterweise noch kein kommerziell erwerblicher
Antikörper gegen den P2Y1 verfügbar, und die wenigen publizierten Daten sind nicht einheitlich
(67;72). Dennoch kann in der Zusammenschau der eigenen Ergebnisse v.a. auch der
Immunfluoreszenz und des FACS davon ausgegangen werden, daß die Expression an der
Zelloberfläche stattfindet und die detekierten Banden auch tatsächlich den P2Y1 repräsentieren.
Eine mögliche Anwendung der Western-Blot-Methode könnte z.B. die Untersuchung einer
Expressionsveränderung der Rezeptoren unter verschiedenen Bedingungen sein, mit Hilfe des
Immunpräzipitation könnten weiterhin beispielsweise mögliche Bindungspartner verifiziert werden
(s.unten).
Auch mittels Immunfloureszenz konnten die beiden transient exprimierten Rezeptoren
nachgewiesen und analysiert werden. Die Immunfloureszenz-Aufnahmen von exprimierten P2X1-
93

Rezeptoren zeigen unabhängig vom Tag ein einheitliches Muster: große, kluster-artige Signale, die
die Zelloberfläche überziehen. Die tatsächliche Expressison an der Zelloberfläche konnte durch
„Durchfokussieren“ der Zellen bestätigt werden. Eine letzte Bestätigung könnte hier die konfokale
Mikroskopie bieten, die außerdem weitere Einblicke über die subzelluläre Verteilung der
Rezeptoren liefern könnte. Die kluster-artigen Signale der P2X1-Rezeptoren könnten die bekannte
Tatsache, daß P2X-Rezeptoren sich zu Oligomeren zusammenlagern, repräsentieren (101).
Auch die Immunfloureszenz-Aufnahmen von exprimierten P2Y1-Rezeptoren zeigen unabhängig
vom Tag ein einheitliches Muster, daß dem des P2X1 ähnlich ist, wobei die Signale etwas kleiner
sind. Die tatsächliche Expressison an der Zelloberfläche konnte hier durch Färbungen ohne
vorhergehende Permeabilisierungen bei Expression des Tags am extrazellulären Teil des
Rezeptors ebenso wie durch „Durchfokussieren“ der Zellen sicher bestätigt werden. Auch hier wäre
die konfokale Mikroskopie eine interessante Methode, die subzelluläre Verteilung der Rezeptoren
näher zu charakterisieren, da die kluster-artigen Signale in dieser Form nicht erwartet waren und
sich deutlich vom Expressionsmuster anderer 7-Transmembran Rezeptoren wie z.B. den betaadrenergen-Rezeptoren
unterschieden (26). Eine Möglichkeit für eine Erklärung könnte die
Organisation der Rezeptoren in subzellulären Kompartimenten wie z.B. Caveolae darstellen: Wie
inzwischen vielfach gezeigt, kommt es auf der Zelloberfläche zu gezielten räumlichen Anreicherung
von Proteinen, die an der Signaltransduktion teilnehmen. Dies ermöglicht der Zelle eine bessere
Steuerung und Integration der Signale von außen (39;105).
Die Möglichkeit, exprimierte Rezeptoren mit Hilfe eines fluoreszenz-markierten Antikörpers im
Durchflußzytometer zu erkennen, wurde nur für den P2Y1-Rezeptor mit einem N-terminalen VSVtag
etabliert. Hier konnte – abhängig von der Höhe der Expression nach der Tranfektion – der
Rezeptor ebenfalls mittels Antikörper gegen den extrazellulären Anteil des P2Y1 als an der
Zelloberfläche exprimiert nachgewiesen werden. Durch diesen Nachweis eröffnet sich ein breites
Spektum an Anwendungsmöglichkeiten auch der nur transient exprimierten Rezeptoren: Da die
Zellen aussortiert werden können, die auch wirklich den Rezeptor exprimieren, kann selektiv diese
Zellpopulation charakterisiert werden. Da heute eine breite Palette von Antikörpern auch gegen
verschiedene Phosphorylierungszustande intrazellulärer Proteine erhältlich sind, kann durch
Färbungen mit einem an einen anderen Fluoreszenz-Farbstoff gekoppelten Antikörper eine ganze
Reihe von Antikörpern gegen verschiedene Proteine aus möglichen intrazellulären Signalwegen
des P2Y1 eingesetzt werden und so relativ einfach verschiedene Signalwege aufgezeigt oder
ausgeschlossen werden.
94

5.9.2 Stabile Expression
Stabile Zelllinien haben gegenüber Zellen mit transienter Expression des gewünschten Proteins
mehrere Vorteile:
1) Interexperimentelle Vergleichbarkeit: Da die Zellen immer dasselbe Expressionsmuster zeigen,
können zeitlich versetzte Versuche besser miteinander verglichen werden als bei transient
transfezierten Zellen, die abhängig vom Erfolg der Transfektion sehr unterschiedliche
Expressionsmuster zeigen können.
2) Unbegrenzte Expansion der Zelllinien und Möglichkeit der Kryokonservierung.
3) Kosten- (Transfektion !) und Zeitersparnis.
4) Möglichkeit der Einzelzelluntersuchung: Da 100% der Zellen das gewünschte Protein
exprimieren, kann jede Zelle untersucht werden. Demgegenüber muß bei transient transfezierten
Zellen immer erst der Expressionsnachweis geführt werden, wenn funktionelle Untersuchungen
gemacht werden.
5) Niedrigere Expressionslevel: Durch die teilweise unphysiologisch hohe Expressionsrate bei der
transienten Transfektion kann es zu funktionellen Artefakten kommen. Diese Gefahr ist bei stabilen
Zelllinien geringer, da – wie oben beschrieben – im allgemeinen niedrigere Expressionslevel
vorhanden sind bzw. man sich die Zelllinien gezielt nach dem gewünschten Expressionlevel
herstellen kann.
Aufgrund dieser Vorteile wurde eine stabile Zelllinie in den 1321N1-Zellen mit dem P2Y1-VSV-C
sowie dem P2X1-C-Flag hergestellt.
5.10 Kalzium-Einzel-Zell-Messungen
Die Herstellung der stabilen Zellininen erfolgte in 1321N1-Zellen, die keine purinergen Rezeptoren
exprimieren (40), da als Voraussetzung für einen Einsatz des Meßsystems der Einzelzell-
Messungen kein Kalzium-Signal in den Ausgangszellen nach Zugabe von ADP oder einem seiner
Derivate auslösbar sein darf. Mit Thrombin stand eine ausgezeichnete Positivkontrolle zur
Verfügung, so daß das Meßsystem v.a. durch seinen geringen Bedarf an Zellen bei sehr guter
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse überzeugt.
5.10.1 P2X1
Wie in der Tabelle 5 dargestellt, sind sowohl ADP, ATP und alpha,beta-Methylen-ATP in dem hier
benutzten Meßsystem in der Lage, Kalziumeinstrom via P2X1 in die Zellen auszulösen. Im
Vergleich zu dem pharmakologischen Profilen, die andere Gruppen (101;148) publiziert haben, sind
Übereinstimmungen bei ATP und dem als selektiven Agonisten beschriebenen αβ-methyl-ATP
feststellbar. ADP dagegen wird in der Literatur kontrovers eingestuft: Von mehreren Gruppen als
95

Agonist eingestuft (148;154), verweisen andere auf Kontaminationen des kommerziell erhältlichen
ADP mit ATP, welches den eigentlichen Effekt vermitteln soll (89). In dem hier vorgestellten System
war mit ADP ein Signal der gleichen Intensität und Charakteristik auslösbar. Das verwendete ADP
war in einer Vorarbeit (49) auf Verunreinigungen mit ATP ausgetestet worden und enthält

Rezeptordichte (wie z.B. überexprimierte Rezeptoren in heterologen Systemen) durchaus in der
Lage ist, Kalzium-Freisetzung vergleichbar dem ADP zu bewirken.
Eine Überprüfung dieser These könnte mittels unterschiedlich exprimierender stabilen Zelllinien
versucht werden: Zwischen massiv überexprimierenden Linien (evtl. auch transient exprimierenden
Zellen) und nur auf niedrigem Niveau exprimierenden Zellen sollte so ein Unterschied im
Antwortverhalten auf ATP messbar sein.
Weiter erschwert wird die genaue Ermittlung des pharmakologischen Profils des P2Y1 durch die
Beobachtung, daß auch Rezeptoren der P2Y-Klasse, und zwar insbesondere der P2Y1,
Heterooligomere mit Adenosinrezeptoren bilden können. Diese zeigen dann ein eigenes, neues
pharmakologisches Profil (166). Auch dies kann nun mittels transienter oder stabiler Ko-Expression
solcher Rezeptoren in den P2Y1-Zellinine systematisch untersucht werden.
5.10.3 Erste Versuche zur Regulation der Rezeptoren
Aus Thrombozyten ist seit längerem bekannt, daß Stimulation sowohl der A-Kinase als auch der G-
Kinase zu einer Hemmung der Kalzium-Freisetzung in den Plättchen führt (50-52). Die stabilen
Zelllinien bieten ein ideales System, eine mögliche Beeinflussung der P2Y1-vermittelten Kalzium-
Freisetzung genauer zu charakterisieren.
Als Voraussetzung müssen jedoch zunächst ein Stimulationsweg bzw. die entsprechenden Kinasen
vorhanden sein.
Die Expression von PG-E1-Rezeptoren und eine tatsächliche Aktivierung der Adenylylcyclase
konnte durch eine Erhöhung der cAMP-Spiegel nach PG-E1 Zugabe gezeigt werden (J. Brich,
Daten nicht gezeigt), die Expression der A-Kinase konnte durch Zunahme der VASP-
Phosphorylierung nach PG-E1-Stimulation in 1321N1-Zellen mittels Western Blot nachgewiesen
werden (P. Hoenig-Liedl, J. Geiger, nicht publiziert).
Trotz vorhandenem Signalweg konnte durch Stimulation mit PG-E1 die Kalzium-Mobilisation durch
P2Y1 in 1321N1-Zellen nicht wie in Thrombozyten vollständig verhindert werden. Allerdings konnte
eine leichte Tendenz hin zu niedrigeren Signalen festgestellt werden. Zur genaueren Auswertung
müßten aber noch eine größe Zahl an Messungen als in der hier vorliegenden Arbeit durchgeführt
werden, evtl. auch mit unterschiedlichen PG-E1-Konzentrationen.
Bei der G-Kinase stellt sich die Sitation anders da: Da die sie nicht ubiquitär exprimiert ist, aber ein
viraler Vektor zur Verfügung stand, wurden die Zelllinien damit infiziert, was zu einer Expression der
G-Kinase in praktisch 100% der Zellen führte. Damit kann also davon ausgegangen werden, daß in
praktisch allen Zellen nach Stimulation mit dem direkten Aktivator 8-pCPT-cGMP eine aktivierte G-
Kinase vorlag.
97

Hier konnte nun in den 1321N1-Zellen keinerlei Beeinträchtigung der P2Y1-vermittelten Kalzium-
Freisetzung gemessen werden. Allerdings sollten auch diese Versuche noch mehrfach wiederholt
werden, eventuell auch mit unterschiedlichen Konzentrationen an 8-pCPT-cGMP.
Prinzipiell konnte aber gezeigt werden, daß mittels der Etabierung der Zelllinien und des Einsatzes
des Einzelzell-Kalzium-Meß-Systems eine relativ einfache Bearbeitung diese Fragestellungen
möglich ist.
Die gefundenen Unterschiede zwischen den Zelllinien und den Thrombozyten können
unterschiedliche Ursachen haben: Möglich wären z.B. unterschiedliche Signalwege in den
verschiedenen Zelltypen, und zwar „downstream“ der Kinasen. Dort könnten Unterschiede im
Expressionsprofil der beiden Zelltypen, wie z.B. einer exklusiven thrombozytären Expression eines
Effektorproteins bzw. fehlenden Expression eines einen Phosphorylierungsschritt hemmenden
Proteins, eine mögliche Ursache des Unterschieds sein.
Ein möglicher Ansatz zur Identifikation eines solch unterschiedlich exprimierten Proteins könnte die
Expression einer Thrombozyten-Bibliothek in den P2Y1-Zelllinien sein: Mittels des funktionellen
Ansatzes einer Messung der Inhibierung des Kalziumsignals könnte beispielsweise nach
Umstellung des Meßsytems auf eine automatisierte 96-well-Auslesung der Fluoreszenz ein
Screening nach diesem Protein durchgeführt werden.
Auch die Möglichkeit der direkten Inhibition der Kalzium-Freisetzung durch Phosphorylierung des
P2Y1-Rezeptors kann durch diese Experimente aber weiterhin nicht ausgeschlossen werden, da
die an diesem potentiell direkten Weg beteiligten Proteine zwar wahrscheinlich auch in den
Astrozytoma-Zellen vorhanden sind, mögliche Modifier- oder Ko-Faktoren allerdings unterschiedlich
exprimiert sein könnten. In der Tat besitzt der P2Y1 in seiner Aminosäure-Sequenz mehrere
potentielle Phosphorylierungsstellen sowohl für die A-Kinase als auch für die G-Kinase. Allerdings
konnte in ersten in-vitro-Phophorylierungs-Studien mit immunpräzipitierten P2Y1-Rezeptoren kein
Anhalt für eine mögliche Phosphorylierung sowohl durch die A-Kinase als auch durch die G-Kinase
gefunden werden (J.Brich und A. Smolenski, Daten nicht gezeigt). Hier jedoch können die jetzt
etablierten Zelllinien einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung dieser Frage beitragen, da die
Rezeptoren durch den Tag besser handzuhaben sind und mit den Zelllininen ein großes Resevoir
an Ausgangsmaterial vorhanden ist.
Ein weiterer möglicher Ansatz zur Eingrenzung der in Frage kommenden Proteine für eine
unterschiedliche Expression wäre die genaue Charakterisierung der durch den P2Y1 aktivierten
Signalwege. Interessant erscheinen hier z.B. die Map-Kinase-Signalwege (27), oder andere, durch
die βγ-Untereinheiten des an durch den P2Y1 aktivierten Gq-Proteins aktivierte Signalwege. Hier
könnte die an den Zelllinie etablierte Methode der FACS-Analyse einen wichtigen Beitrag liefern,
98

die auch mit transient exprimierten Rezeptoren eine Analyse verschiedener Zell-Typen und
unterschiedlicher Kinasesubstrate erlaubt.
Ein weiterer Ansatz könnte die Suche nach möglichen intrazellulären Bindungspartnern des P2Y1
sein, z.B. mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Ansatzes. Zur Verifizierung möglicher Kandidaten
könnten wiederum die Zelllinien einen entscheidenden Beitrag leisten, da die getaggten Rezeptoren
einen Ko-Immunopräzipitationsansatz (sogennanter Pull-Down-Assay) ermöglichen könnten. Einen
ersten Hinweis auf mögliche Bindungspartner konnten bereits Hall et al. 1998 liefern, als sie zeigen
konnten, daß über eine C-terminale PDZ-Domäne ein Na/K + -Austauschfaktor an P2Y1 binden kann
(60). Diese Ergebnisse könnten so Schritt für Schritt zu einer Aufklärung von Signalwegen führen.
99

6. Zusammenfassung
Die Thienopyridine Ticlopidin und Clopidogrel sind seit mehreren Jahren im klinischen Einsatz als
Thrombozytenaggregationshemmer zur Sekundärprophylaxe bei arteriosklerotischen Erkrankungen
der Herzgefäße, zerebralen Gefäße sowie der peripheren Arterien. Trotz ihrer nachgewiesenen
klinischen Wirksamkeit war der Wirkmechanismus lange Zeit auf die Beschreibung als ADP-
Rezeptorantagonist beschränkt. Im Zuge neuerer Erkenntnisse zum Mechanismus der Auslösung
einer Aggregation, insbesondere der ADP-vermittelten Aggregation, sollte im Rahmen dieser
Dissertation der Wirkmechanismus der Thienopyridine genauer untersucht werden sowie mögliche
Auswirkungen auf intrazelluläre Kaskaden, die den aggregationshemmenden Effekt vermitteln. Zu
diesem Zweck wurden die Effekte einer Thienopyridin-Einnahme auf die Thrombozytenfunktion
gesunder Probanden untersucht. In unseren Versuchen bestätigte sich die gute Wirksamkeit der
Substanzen hinsichtlich der deutlichen Reduktion der ADP-vermittelten Aggregation. Vor dem
Hintergrund eines damals neu propagierten Drei-Rezeptoren-Modells für die ADP-vermittelte
Aggregation konnten wir erstmals den Wirkmechanismus an humanen Thrombozyten auf eine
Inhibierung des P2Yac-Rezeptors eingrenzen. Weiterhin konnten wir unter Thienopyridin-Einnahme
eine Aufhebung der ADP-vermittelten Hemmung der PG-E1-vermittelten VASP-(VAsodilator-
Stimulated Phosphoprotein) Phosphorylierung feststellen und somit einen wichtigen Beitrag zum
Verständnis der Wirkung der Substanzen beitragen (48).
Zum besseren Verständnis der zum damaligen Zeitpunkt bereits auf molekularer Ebene bekannten
humanen thrombozytären ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2X1 wurden diese aus humanen
Thrombozyten kloniert und mit verschiedenen Tags versehen in einer Astrozytoma-Zelllinine
transient und stabil exprimiert. Es wurden verschiedene zellbiologische Methoden wie
Immunpräzipitation, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz etabliert, die als Grundlage für
weitere Untersuchungen der intrazellulären Signalkaskaden der Rezeptoren dienen können. Die
stabil exprimierenden Zelllinien dienten zur Verifizierung des pharmakologischen Profils der
Rezeptoren, weiterhin konnten bereits erste Versuche zu einer möglichen Regulation der
Rezeptoren durch zyklische Nukleotide durchgeführt werden. Durch die Etablierung dieser
Zelllininen wurde insgesamt eine gute Grundlage für eine weitere Charakterisierung dieser ADP-
Rezeptoren unter besser standardisierbaren Bedingungen geschaffen.
100

7. Abkürzungen und Maßeinheiten
1-Me-ADP 1-Methyladenosin-5’-diphosphat
2-Cl-ADP 2-Chloro-adenosin-5’-diphosphat
8pCPT-cGMP 8-(4-Chlorophenylthio)guanosin-3‘,5‘-zyklomonophosphat
αβmeATP Adenosin-5’-(α,β-methylen)triphosphat
Abb. Abbildung
AC Adenylyl Cyclase
ADP Adenosin 5‘-diphosphat
Amp Ampicillin
ASS Acetylsalicylsäure
ATCC American Tissue Culture Collection
ATP Adenosin-5’-triphosphat
BSA Bovines Serumalbumin
Ca 2+ Kalzium(II)ion (zweiwertiges Kalzium)
cAK cAMP-abhängige Proteinkinase
cAMP Adenosin 3‘,5‘-zyklomonophosphat
cDNA komplementäre DNA
cGK cGMP-abhängige Proteinkinase
cGMP Guanosin 3‘,5‘-zyklomonophosphat
c-myc humane c-myc-Protein, Peptid-Sequenz EQKLISEEDL
Da Dalton
DAG Diacylglycerin
dADP 2’Deoxy-adenosin 5’-diphosphat
dH20 destilliertes Wasser
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsaeure
ECL Enhanced Chemiluminescence
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid, Disodium Salt
(di-Natrium-ethylendiamintetraacetat)
EGTA Ethylenglycol-bis(ß-Aminoethyl Ether)-N,N,N‘,N‘-Tetraessigsäure
ELISA Enzyme-linked immuno(ab)sorbent assay
101

Epi (Adr) Epinephrin (Adrenalin)
FCS Fetal Calf Serum
FLAG Peptid-Sequenz DYKDDDDK
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
GC Guanylyl Cyclase
GDP Guanosin 5‘-diphosphat
Gi inhibitorisches G-Protein
GP Glykoprotein
Gs stimulatorisches G-Protein
GTP Guanosin 5‘-triphosphat
HA human influenza hemagglutinin-Protein, Peptid-Sequenz YPYDVPEDPED
HCl Salzsäure
HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N‘-[2-ethanesulfonsäure]
IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalakto(pyrano)sid
Kan Kanamycin
NaOH Natriumhydroxid
NO Stickstoffmonoxid
p.o. per oral
PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
PAR protease activated receptor (Protease-aktivierter Rezeptor)
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatpuffer)
PCR Polymerase Chain Reaction
pH pH-Wert
PDE Phosphodiesterase
PG-E1 Prostaglandin E1
PG-I2 Prostaglandin I2; Prostacyclin
PI-3 Kinase Phosphatidylinositol-3 Kinase
PKC Proteinkinase C
PPP platelet poor plasma (Plättchenarmes Plama)
PRP platelet-rich plasma (Plättchenreiches Plasma)
SDS Sodium-dodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Ser157 Serin an Position 157
Ser239 Serin an Position 239
102

SNP Sodium nitroprusside (Natrium Nitroprussid)
Tab. Tabelle
TCA Tri-chloro-acetic acid
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan
TxA2 Thromboxan A2
VASP Vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein
VSV-G vesicular stomatitis virus glycoprotein G; Peptidsequenz YTDIEMNRLGK
v/v Volume per Volume
vWF von Willebrand Faktor
WP washed platelets (gewaschene Plättchen)
w/v Weight per Volume
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galaktosid
A Ampère
Bp Base Pair(s)
Bq Becquerel
°C Grad Celsius
Ci Curie (1 Ci = 37 x 10 9 Bq)
cpm counts per minute (Anzahl pro Minute)
Da dalton (g/mol)
g Erdbeschleunigung (9,81 m/s 2 )
g Gramm
l Liter
m Meter
M Molar (mol/Liter)
rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)
U Unit (Enzymeinheit, Umsatz von 1 µmol Substrat / min)
V Volt
n nano (10 -9 )
µ mikro (10 -6 )
m milli (10 -3 )
k kilo (10 3 )
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Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand am Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie der
Medizinischen Universitätsklinik Würzburg unter der Leitung von Prof. Dr. med. Ulrich Walter. Ihm
möchte ich für die Bereitstellung und das finanzielle Ermöglichen der Arbeit danken. Der Begriff
„Doktorvater“ wurde von ihm vollständig besetzt: Weit über die fachlich hervorragende Betreuung
hinaus war er auch bei wichtigen persönlichen Entscheidungen immer ein hilfreicher und
freundschaftlicher Berater. Besonders bedanken möchte ich mich auch für die Organisation meines
USA-Aufenthaltes bei Prof. J. Herz in Dallas sowie für die kurzfristige überbrückende Anstellung als
Arzt im Praktikum in seinem Institut.
Dr. rer. nat. Jörg Geiger danke ich für die herausragende Betreuung meiner Arbeit. Durch ihn
bekam ich ein Verständnis für wissenschaftliche Arbeiten über meine Doktorarbeit hinaus sowie
eine Inspiration für die Entwicklung eigener Ideen, welche ich durch den gewährten Freiraum und
Eigenständigkeit auch umsetzen konnte. Auch durch seine besondere Art entstand im „Labor 211“
eine stets freundschaftliche und herzliche Atmosphäre.
Frau Petra Hönig-Liedl danke ich ebenfalls im Besonderen: Durch ihre geduldige und herzliche Art
vermittelte sie mir die Grundlagen des Labor-Arbeitens und -Alltags, die ich bis heute als „Gold-
Standard“ schätzen gelernt habe. Ihre freundschaftliche Art trägt ganz wesentlich zur guten
Erinnerung an meine Laborzeit bei.
Herrn Gunnar-Ingi Kristjansson danke ich für eine ausgezeichnete Einführung in die Welt der
Molekularbiologie. Durch die Weitergabe seiner großen Erfahrungswerte konnte ich in relativ kurzer
Zeit ein breites Spektrum an neuen Methoden und Verfahren erlernen. Auch ihm danke ich für ein
außergewöhlich gutes persönliches Verhältnis.
Herrn Dr. med. Albert Smolenski danke ich für seine weit über das übliche hinausgehende
Unterstützung im Bereich Zellkultur sowie für seine freundliche und stets hilfsbereite ruhige Art.
Für eine gute Akzeptanz und Unterstützung sowie die stets vorhandenen Diskussionsmöglichkeiten
möchte ich mich bei PD Dr. M. Eigenthaler, Dr. M. Reinhard, PD Dr. E. Butt-Dörje, Dr. T. Jarchau,
PD Dr. A. Simm sowie Prof. Dr. M. Zimmer bedanken.
Für eine ausgesprochen angenehme und freundschaftliche Arbeitsatmosphäre danke ich allen
Mitarbeitern des Institutes für Klinische Biochemie und Pathobiochemie, im besonderen bei Maisa
Garcia-Arguinzonis und Barsom Aktas, Elfi Walter, Ulrike Schwarz, Christiane Bachmann,
Wolfgang Hauser, Lilo Fischer und Petra Thalheimer.
Herrn PD Dr. med. J. Bauersachs danke ich für die Übernahme des Koreferates.
Diese Arbeit ist meinen lieben Eltern gewidmet, die mich über die ganze Zeit stets motivierend
begleitet und immer - nicht zuletzt auch finanziell – unterstützt haben.

Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name, Vorname: Brich, Jochen
Geburtsdatum, -ort: 26.04.1974, Ansbach
Familienstand: ledig
Schulbildung:
09/1980 – 07/1984 Grundschule Ansbach
09/1984 – 07/1993 Theresiengymnasium Ansbach
Zivildienst:
08/1993 – 10/1994 Ambulante Krankenpflegestation der Caritas in Ansbach
Hochschulbildung:
11/1994 bis 5/2002 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians-Universität
Würzburg
09/1996 Ärztliche Vorprüfung
08/1997 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2000 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
05/2002 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr:
03/2001 – 06/2001 Department of Human Genetics, University of Texas, Southwestern
Medical Center in Dallas, TX, USA
08/2001 – 12/2001 Innere Medizin, Medizinische Universitätsklinik Würzburg
12/2001 – 04/2002 Chirurgie, Chirurgische Universitätsklinik Würzburg
Ärztliche Tätigkeiten:
08/2002 – 10/2002 Arzt im Praktikum am Institut für Klinische Biochemie und
Pathobiochemie / Zentrallabor der Julius-Maximilians-Universität
Würzburg; Leitung: Prof. Dr. med. Ulrich Walter
11/2002 – 01/2004 Arzt im Praktikum an der Neurologischen Universitätsklinik Freiburg;
Leitung: Prof. Dr. med. Dr. hc. C. H. Lücking
02/2004 - Assistenzarzt an der Neurologischen Universitätsklinik Freiburg;
Leitung: PD Dr. med. A. Hetzel
Promotion:
10/1997 bis 11/1999 Experimentelle Arbeit:
Prof. Dr. med. Ulrich Walter, Institut fur Klinische Biochemie und
Pathobiochemie der Universität Würzburg; Arbeitsgruppe: Dr. rer. nat.
Jörg Geiger
Thema: Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen
Thrombozyten
Wissenschaftliche Aktivitäten:
05/2000 – 06/2001 Forschungsaufenthalt bei Prof. Joachim Herz, Department of Molecular
Genetics, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX,
USA
Stipendien:
05/2000 – 10/2000 Ernst und Hedda Wollheim Stiftung, Würzburg
11/2000 – 06/2001 Boehringer-Ingelheim Stiftung, Heidesheim