Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

3. Methoden 20
3.1 Studienaufbau / Probanden 20
3.1.1 Ticlopidin – Probanden - Studie (Studie PLA 095.097) 20
3.1.2 Clopidogrel – Probanden - Studie (Studie PLA 095.097) 20
3.2 Thrombozytenpräparation aus Vollblut 21
3.3 Thrombozyten-Aggregationsmessungen 21
3.4 Intrazelluläre Calciummessungen in Thrombozyten 22
3.4.1 Präparation von gewaschenen Thrombozyten 22
3.4.2 Prinzip der Calcium-Messungen 22
3.4.2.1 Messung der Calcium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern 23
3.4.2.2 Messung der Calcium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern
und zusätzlich des Calcium-Influxes 23
3.5 cAMP-Bestimmung in Thrombozyten 23
3.5.1 Extraktion von cAMP aus Thrombozyten 23
3.5.2 Bestimmung der cAMP-Konzentration durch Radioimmunoassay 24
3.6 Immunologischer Nachweis von Proteinen durch Western-Blot-Technik 24
3.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 24
3.6.2 Transfer auf Nitrocellulose-Filter 25
3.6.3 Anfärben der Proteine auf Nitrocellulose-Filtern 25
3.6.4 Absättigung unspezifischer Bindungsstellen 26
3.6.5 Inkubation mit spezifischen Antiseren 26
3.6.6 Nachweis der Proteine 26
3.6.6.1 Nachweis durch jodiertes Protein A bzw. jodierte Anti-Maus-
Antikörper 26
3.6.6.2 Nachweis durch Chemolumineszenz 27
3.6.7 Quantitative Auswertung der radioaktiven Immunomarkierung 27
3.7 Probenaufbereitung der Proteine für den Nachweis mittels Western-Blot-Technik
3.7.1 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von VASP-Proteinen
27
aus Thrombozyten 27
3.7.2 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von Proteinen
aus Zellkultur-Zellen 28
3.7.2.1 Direkter Protein-Nachweis aus Zellkultur-Zellen 28
3.7.2.2 Proteinnachweis nach Immunpräzipitation 28