Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

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Abb. 26: Immunpräzipitation mit dem VSV-Antikörper bei P2Y1-VSV-C
exprimierenden COS-7 Zellen. Spur 1: Proteinstandard, Spur 2: frei,
Spur 3: Zelllysat vor IP, Spur 4: Überstand des Präzipitats, Spur 5:
Präzipitat des VSV-Antikörpers in mit Lipofectamine-transfezierten P2Y1-
VSV-C in COS-7 Zellen, Spur 6: Präzipitat des VSV-Antikörpers in mit
Lipofectamine-transfeziertem Leervektor pcDNA3 in COS-7 Zellen.
Im Vergleich der Spur 5, den mit dem P2Y1-VSV-C Plasmid transfezierten Zellen, mit der Spur 6,
den nicht transfezierten Zellen, fallen zwei Unterschiede auf: eine zusätzliche Bande bei ca. 45 kD
sowie ein „verschmiertes“ Signal von 70 kD an bis zum oberen Rand des Geles. Die einzelne
Bande stellt vermutlich die native Form des Rezeptores dar, also die nicht durch Glykosilierungen
modifierte Aminosäurekette aus dem endoplasmatischen Retikulum. Die Bandengröße entspricht
daher auch in etwa der vorher kalkulierten Größe des Rezeptors von ca. 42 kD, da diese
Kalkulation auf der Länge und Zusammensetzung der Aminosäure-Sequenz basiert.
Das „verschmierte“ Signal von ca. 70 kD an aufwärts würde dann den unterschiedlich glykosylierten
Proteinen entsprechen. Die Aminosäuresequenz des P2Y1 beeinhaltet mehrere mögliche
Glykosylierungsstellen. In der Tat ist für verschiedene 7-Transmembran-Rezeptoren, die gykosyliert
werden, ein ähnliches Signal in Western-Blots gezeigt worden (57).
4.9.2.2 Nachweis der Expression von P2X1 mittels der Western-Blot-Technik
Die Methode des Western-Blot-Nachweises wurde auch für den P2X1-Rezeptor angewandt. Dieses
Protein erwies sich als stabiler und / oder höher exprimiert und konnte auch ohne
Immunpräzipitation regelmäßig und zuverlässig nachgewiesen werden. Die im Gel beobachtete
Bande stimmte mit dem vorher theroretisch kalkulierten Molekulargewicht von ca. 60 kD gut
überein.
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