Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Dabei ergab sich folgendes Bild:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Abb. 31: Ergebnis der RT-PCR von 10 Zelllinien (Spuren 2-
11) nach 3-wöchiger Selektion mit G418. Spur 12: Negativ-
Kontrolle (nicht transfezierte Zellen). Spur 13: Positiv-
Kontrolle (Vektor P2Y1-nat als PCR-Template). Spuren 1
und 14: DNA-Größenstandards.
Somit zeigen die Zelllinien 6 und 10 (Spur 7 und 11) eine Bande in der erwarteten Größe.
Für das Konstrukt P2X1-C-Flag wurde als Nachweismethode für die stabile Expression das
Western-Blot-Verfahren gewählt. Dabei zeigten von den insgesamt 20 getesteten Zellpopulationen
15 eine Expression des P2X1-C-Flag Rezeptors. Davon wurde 3 Zelllinien mit jeweils
unterschiedlich starker Expression für die Reklonierung ausgewählt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb. 32: Screening von Zelllinien, die das P2X1-C-
Flag-Konstrukt stabil exprimieren, mittels Western-
Blot (Antikörper Anti-Flag-M2). Spuren 1-8:
Astrozytoma-Zelllysate, die die Selektion mit G-418
tolerieren. Spur 9: Astrocytoma Zelllysat als
Negativ-Kontrolle. Spur 10: Astrozytoma-Zelllysat,
die das P2X1-N-Flag Plasmid transient
exprimieren.
Da zu Beginn der Selektion mehr als eine einzelne Zelle pro well vorhanden war, waren die
positiven Klone noch immer Mischklone mit zum Teil erheblichen Unterschieden im
Expressionsverhalten. Um echte Einzelzell-Klone zu erhalten, wurden die nach dem Screening
positiven Zellen nochmals auf 96-well-Platten verdünnt, diesmal so berechnet, daß höchstens eine
Zelle pro well vorliegen würde.
Die Zellen aus wells, die Zellwachstum zeigten, wurden dann einer erneuten Überprufung auf ihr
Expressionsverhalten unterzogen. Bei den mit Immunfluoreszenz nachweisbaren Konstrukten
(P2Y1-VSV-C und P2X1-C-Flag) zeigte sich nun ein homogener Expressionslevel der Zellen. Sie
wurden entsprechend oben beschriebenem Schema expandiert und ein Teil für spätere Versuche
kryokonserviert.
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