Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

allerdings auf einem niedrigeren Niveau als bei der transienten Expression, da – abhängig von der
Anzahl der integrierten Vektor-DNAs – nicht mehr so viele Kopien wie bei der transienten
Expression vorliegen.
4.9.1 Transiente Expression
Die transiente Expression eignet sich – bedingt durch die starke Überexpression des Konstruktes -
insbesondere für Ansätze, in denen größere Mengen des Proteins benötigt werden, wie z.B. für
Western-Blots.
Da zum Zeitpunkt dieser Arbeiten noch keine veröffentlichen Daten zur einer heterologen
Expression der Rezeptoren P2Y1 und P2X1 vorlagen, mußte als erster Schritt die Expression des
Konstrukte verifiziert werden.
4.9.2 Immunologischer Nachweis durch Western-Blot-Technik
4.9.2.1 Versuch des Nachweises der Expression von P2Y1 mittels der Western-Blot-Technik
In diesem zunächst einfachsten technischen Verfahren werden die Zellen 3 Tage nach Transfektion
- nach Entfernung des Mediums und mehrmaligem Waschen mit PBS - mit heißer SDS-Stop-
Lösung direkt von der Petrischale gelöst und damit auch lysiert. Nach fakultativem mehrminütigem
Aufkochen der Probe kann diese direkt auf ein Polyacrylamid-Gel geladen werden und
entsprechend dem oben beschriebenen Western-Blot-Protokoll (siehe 3.1.6) kann nun versucht
werden, den Rezeptor mittels eines gegen den entsprechenden Tag gerichteten Antikörpers als
Bande im Gel nachzuweisen.
Leider konnte mit keinem der verschiedenen Tag-Antikörper eine Bande nachgewiesen werden.
Da eine der möglichen Ursachen für dieses Problem eine zu geringe Expression sein könnte,
wurde als Methode zur Konzentrierung der Probe die Immunpräzipitation verwendet.
Hier konnten dann - nach Weglassen des Aufkochschrittes – und bei Verwendung des
transfezierten P2Y1-VSV-C Konstruktes und des VSV-Antikörpers folgende Banden detekiert
werden:
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