Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

3x SDS-Lösung:
Tris 200 mM
SDS 6%
Glycerin 15%
Bromphenolblau
ad 100 ml dH2O
0,003%
1x SDS-Lösung:
3x SDS 450 µl
ß-Mercaptoethanol 50 µl
dH2O 1 ml
3.7.2 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von Proteinen aus Zellkultur-Zellen
3.7.2.1 Direkter Protein-Nachweis aus Zellkultur-Zellen
Die Zellen werden in 6-Well-Patten ausgesät. Das Medium wird in einem Well abgesaugt und die
Zellen 2 mal mit PBS gewaschen. Dann wird 30-50 µl heiße 1x SDS-Lösung direkt auf die Zellen in
einem Well pipettiert, diese mit einem Zellspatel abgekratzt und ein Eppendorf-Cap überführt.
Fakultativ werden die Proben für 1-10 Minuten bei 95°C gekocht und dann bei –20°C eingefroren.
Vor dem Auftragen werden die Proben fakultativ für einige Minuten bei 80°C erhitzt. Pro Geltasche
werden zwischen 10 und 50 µg Gesamt-Protein aufgetragen.
3.7.2.2 Protein-Nachweis nach Immunpräzipitation
s. Methoden Immunpräzipitation 3.9.8
3.8 Methoden Molekularbiologie
3.8.1 Zentrifugation
Alle im folgenden nicht näher erläuterten Zentrifugationsschritte in Eppendorfgefäßen werden in
einer Zentrifuge vom Typ 5415C der Firma Eppendorf bei Raumtemperatur und 14000 rpm
ausgeführt.
3.8.2 Präparation kleinerer Mengen Plasmid-DNA für Klonierungen und Sequenzierungen
Kleinere Mengen an Plasmid-DNA (bis 50 µg) werden mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit
aufgereinigt. Die Präparation erfolgt nach Standardprotokoll. Nach Elution mit 50 µl dH2O wird die
Konzentration der Plasmid-DNA mittels OD-Messung (siehe 3.8.1.4) bestimmt und standardmäßig
auf 0.1 µg/µl eingestellt. Die DNA wird dann bei –20°C gelagert.
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