Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

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Abb. 25: Autoradiographie der Elektrophorese der
TNT-translatierten Plasmide P2Y1-N-FLAG (Spur 1),
P2Y1-N-FLAG/C-c-myc (Spur 2), P2X1-C-FLAG (Spur
3), P2X1-N-FLAG/C-c-myc (Spur 4), Luciferase
(Positiv-Kontrolle) (Spur 5), Mix ohne Template
(Negativ-Kontrolle) (Spur 6), P2Y1-nat (Spur 7),
Luciferase (Positiv-Kontrolle) (Spur 8).
Die beiden Rezeptoren erscheinen im erwarteten Bereich ihres theoretisch kalkulierten molekularen
Gewichtes (ausgewertet durch den relativen Vergleich zur Laufgeschwindigkeit der Positivkontrolle,
s.u.). Durch die unterschiedlichen Tags kommt es allerdings zu einem überraschend deutlichen
Unterschied der einzelnen Konstrukte. Da auch die Positiv-Kontrolle (mitgeliefertes Luciferase-
Plasmid) im erwarteten Bereich von ca. 60 kDa auftaucht sowie die Spur mit der Negativ-Kontrolle
(kein Vektor zugegeben, aber Reaktionsmix mit Radioaktivität zupippetiert) keine Bande aufweist,
kann von einem Funktionieren sowohl der Reaktion als auch der Rezeptor-Plasmide ausgegangen
werden.
4.9 Expression in zellulären Systemen
Prinzipiell können Plasmide auf zwei verschiedene Arten in Zellen exprimiert werden: transient oder
stabil. Transiente Expression ist gekennzeichnet durch eine kurzfristige, sehr starke
Überexpression des Konstruktes, da das Plasmid nach der Transfektion in vielfacher Ausführung in
der Zelle vorliegt. Die Expression beginnt ca. 1-2 Tage nach dem Transfektionsvorgang, und endet
nach ca. 4-6 Tagen, was auf eine Degradierung der Plasmid-DNA durch zelleigene Nukleasen
zurückzuführen ist. In Abhängigkeit vom Zelltyp und dem gewählten Transfektionsverfahren beträgt
der Anteil der exprimierenden Zellen zwischen 5 und 80 % (Transfektionseffizienz).
Bei der stabilen Expression setzt man die Zellen wenige Tage nach der Tansfektion unter
Selektionsdruck mit einem zelltötenden Antibiotikum (meist Neomycin/G418). Da die Plasmide ein
Resistenzgen enthalten, werde nur diejenigen Zellen länger als 10 Tage überleben, die die Vektor-
DNA spontan und in zufälliger Art und Weise in ihr Genom integriert haben. Diese Zellen werden
auf ihr Expressionsverhalten hin untersucht und in einem Re-Klonierungsschritt in eine homogene
Zelllinie überführt, die nun das gewünschte Protein weiter unter dem vektoreigenen Promoter
exprimiert, so daß von einer “stabilen Zelllinie” gesprochen wird: Nach der Zellteilung wird auch die
Tochterzelle die integrierte Plasmid-DNA enthalten und das gewünschte Protein exprimieren,
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