Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Als Trenngel wird in allen Fällen ein 9%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel mit der folgenden
Zusammensetzung verwendet:
2 Trenngele (9% Acrylamid):
30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 6 ml
3 M Tris-HCl pH 8,9 2,5 ml
10%-ige SDS-Lösung 200µl
TEMED 10 µl
dH2O 11,22 ml
APS 10% 200 µl
Es werden ausschließlich Gele von 1 mm Dicke verwendet. Die Elektrophorese wird mit einer
Maximalspannung von 100 Volt begonnen (Sammelgel), nach Übertritt der Proteine in das Trenngel
wird die Spannung auf maximal 150 Volt erhöht.
Elektrophoresepuffer, pH 8,9:
Tris 25 mM
Glycin 0,2 M
SDS 0,1%
3.6.2 Transfer auf Nitrocellulose-Filter
Nach Ende der Elektrophorese wird ein Nitrocellulose-Filter auf das Trenngel gelegt, beide
zusammen luftblasenfrei zwischen Whatman-Filterpapier und Kunststoff-Vliese in Plastikgitter
geklemmt und in eine mit auf 4°C vorgekühltem Transferpuffer gefüllte Blotkammer gegeben. Der
Transfer der Proteine von dem Gel auf die Nitrocellulose erfolgt durch eine senkrecht zu dem Gel
angelegte Spannung von 60-80 V für 60 Minuten bei 4°C.
Transferpuffer, pH 10,0:
Tris 25 mM
Glycin 192 mM
Methanol 20%
3.6.3 Anfärben der Proteine auf Nitrocellulose-Filtern
Zur Kontrolle der Transfereffizienz und zur Markierung der Positionen der Molekulargewichts-
Standards werden die Nitrocellulose-Filter nach erfolgtem Transfer mit 0.1% (w/v) Ponceau S in 5%
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