Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

ewirkt eine Dephosphorylierung der 5’-Enden und verhindert damit eine mögliche Religation des
Plasmids.
Nach Zugabe von 50 µl dH2O werden die Ansätze mit Hilfe des QIAquik PCR Purification Kit
aufgereinigt und mit 40 µl dH2O eluiert, was eine automatische Verdünnung auf ca. 0,1 µg/µl zur
Folge hat.
3.8.12.2 Analytische Spaltungen
Für analytische Spaltungen von Plasmid-DNA wird ein Gesamtreaktionsansatz von 20 µl für 300 ng
DNA gewählt. Normalerweise werden für den Verdau von 1 µg 5-10 U des betreffenden Enzyms
verwendet und der Ansatz bei der für das jeweilige Enzym optimalen Temperatur für mind. 1,5 h
inkubiert und dann auf einem Agarosegel analysiert.
3.8.13 Ligation von DNA-Fragmenten
Ligationspuffer (5-fach oder 10-fach konzentriert) wird vom Hersteller mitgeliefert.
Zur Ligation von DNA-Fragmenten (z.B. Insertion von Fragmenten in einen Vektor) werden
üblicherweise in einem Ligationsansatz von 20 µl zusammenpipettiert:
Vektor-DNA 50 ng
Insert-DNA in einem 5-20-fachen molarem Üeberschuß
T4 DNA-Ligase
Ligationspuffer
ad 20 µl dH2O
20-40 U
Der Ansatz wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
Für die Klonierung von DNA-Fragmenten, die durch eine PCR mit der Pfu-Polymerase (welche
“stumpfe Enden” produziert) entstehen, wird der Klonierungs-Vektor pPCR-Script Amp SK (+)
verwendet, der im PCR-Script Amp Cloning Kit enthalten ist (Standardprotokoll).
3.8.14 Transformation kompetenter E.coli Zellen
Die Transformation der Epicurian Coli XL 1-Blue MRF’ Kan supercompetent cells von
STRATAGENE erfolgte mit der Hitzeschock-Methode nach Standardprotokoll.
3.8.15 Verifizierung der Plasmide mit Insert
Da nicht alle Plasmide über eine “Blau/Weiß”-Selektionsmöglichkeit (ein aufgenommenes Insert
ruptiert das ursprünglich im Plasmid vorhandene Gen für die β-Lactamase, das in den Platten
enthaltetes β-Gal-Substrat in ein blaues Substrat metabolisieren kann: die Kolonien der Plasmide
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