Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Die Herstellung der Zelllinien erfolgte nach folgendem Protokoll:
1. 1321N1 Zellen wurden mit den Konstrukten P2Y1-VSV-C, P2Y1-nat und P2X1-C-Flag
transfeziert.
2. Nach 48 Stunden wurde die Zellen gesplittet und auf eine 96-well-Platte so verdünnt, daß nur
einige wenige Zellen in jedem well vorlagen. Außerdem wurde G418 in der Konzentration von 1
µg/ml zugegeben. Diese Konzentration war in Vorversuchen ausreichend, um alle nicht
transfezierten Zellen innerhalb von 3-5 Tagen zu töten.
3. Nach regelmäßigem Mediumwechsel zeigte sich nach ca. 2 Wochen folgendes Bild: In
denjenigen wells, in denen Zellen die Selektion mit G418 überlebt hatten, verfärbte sich das
Medium 1-2 Tage nach letzmaligem Wechsel von rot nach gelb-orange als Zeichen des Verbrauchs
von Nährstoffen und dem damit verbundenen pH-Wert-Wechsel. Diese Zellen wurden auf größere
Platten expandiert: Erst auf 24-well-Platten, dann auf 12-well-Platten und schließlich auf 6-well-
Platten.
Für das Konstrukt P2Y1-VSV-C wurde ein Teil dieser Zellen dann für Immunfluoreszenzaufnahmen
genutzt. Da sich zum Zeitpunkt des Beginns der Selektion nicht nur eine Einzelzelle in einem well
befand, waren auch nach der Selektion nicht alle vorhandenen Zellen Nachfolger einer Zelle, also
„Klone“ dieser einen Zelle, sondern die Summe der Nachfolger verschiedener Ausgangszellen, die
recht unterschiedliche Expressionsmuster zeigen können, bzw. bei Integration von nur dem
Resistenzgen aus dem Plasmid ohne dem darin integrierten Rezeptor überhaupt keine Expression
zeigen.
Für den Nachweis des Konstruktes P2Y1-nat, das keinen Tag enthält und für das auch kein
Antikörper existiert, wurde die RT-PCR als Nachweisverfahren eingesetzt.
Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode zum Nachweis einer Expression. Allerdings ist sie eine
indirekte Art des Nachweises einer Expression, da nicht das Protein und damit das Endprodukt der
Translation nachgewiesen wird, sondern die Boten-RNA, das Produkt der Transskription. Somit
kann der letzte Schritt der Translation nicht nachgewiesen werden. Da aber erfahrungsgemäß die
Translation eines nativen Proteins ein eher unkritischer Schritt ist, kann im allgemeinen der
Nachweis der mRNA mit einer Expression des in der jeweiligen mRNA codierten Proteins
gleichgesetzt werden. Nach Präparation der RNA aus den Astrocytoma-Zellen wird zunächst der
sogenannte First-Strand mittels des Enzyms Reverse Transkriptase hergestellt. Dann wird mit den
spezifischen Primern GIK 160 und GIK 161 eine PCR gestartet, die als Produkt die fast komplette
codierende Sequenz des P2Y1 liefert.
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