Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

3.8.3. Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA für Transfektionen
Für die Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA wird der Pasmid-Midi Kit (QUIAGEN) (für DNA-
Mengen bis 100 µg) oder der Plasmid Maxi Kit (QUIAGEN) (bis 500 µg) verwendet. Die Präparation
erfolgt nach Standardprotokoll. Nach Bestimmung der Konzentration durch OD-Messung (siehe
3.8.1.4) wird die Plasmid-DNA standardmäßig auf 1 µg/µl eingestellt und bei –20°C gelagert.
3.8.4 DNA-Konzentrationsbestimmung durch Messung der optischen Dichte (OD)
Die Konzentration der Nukleinsäuren wird mit Hilfe der Bestimmung der optischen Dichte im
Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm errechnet. Dabei gelten folgende
Beziehungen: Die OD 260 von 1 entspricht einer Konzentration doppelsträngiger Nukleinsäuren
von 50 µg/µl und einer Konzentration einzelsträngiger Nukleinsäuren (z.B. Oligonukleotide oder
RNA) von 30 µg/µl.
3.8.5 Horizontale Agarosegel-Elektrophorese zum Auftrennen von DNA-Fragmenten
Für die analytische bzw. präparative Auftrennung von DNA-Molekülen wird eine horizontale
Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Je nach Größe der DNA-Moleküle wird dabei eine
Agarosekonzentration zwischen 1% und 1,5% verwendet. Zunächst wird die Agarose in 1x TAE-
Puffer durch Aufkochen gelöst. Nach Abkühlen wird Ethidiumbromid (0.5-1 µg/ml Endkonzentration)
zugesetzt und die Lösung luftblasenfrei in die horizontale, mit Kämmen bestückte Gelhalterung
gegossen. Als Laufpuffer dient 1x TAE. Die Elektrophorese erfolgt je nach Kammergröße bei 40-
150 V (3-6 V/cm). Die DNA-Moleküle im Agarosegel werden unter UV-Bestrahlung (λ=312 nm)
durch das in die DNA interkalierte, orange-fluoreszierende Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
50x TAE:
Tris 2,0 M
Eisessig 57,1 ml
Na-EDTA 50 mM
3.8.6 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel Extraction Kit
Zur Aufreinigung von durch Gelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
werden diese unter kurzfristiger UV-Licht-Kontrolle mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit dem
QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt (Standardprotokoll). Die Säulen werden mit 40 µl dH2O
eluiert und das Eluat bei –20°C gelagert.
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