Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

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eine Xho I-Schnittstelle und die für das VSV-Epitop kodierende Sequenz enthält, mittels PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-VSV-C bezeichnet. 4.7.4 Klonierung eines Expressionsvektors ohne Tags für P2Y1 (P2Y1-nat) Beschreibung: Im Fall des P2Y1 wurde auch ein Expressionvektor kloniert, der nur die cDNA von P2Y1 enthält. Als Vektor wurde wiederum pcDNA3 mit den Schnittstellen BamH I und Xho I eingesetzt. Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 154, der eine BamH I-Schnittstelle und eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz enthält, und GIK 155, der eine Xho I-Schnittstelle enthält, mittels PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-nat bezeichnet. 62
4.7.5 Zusammenfassung Plasmid Vektor PCR-Produkt- Schnittstellen P2Y1- N-FLAG P2Y1- C-FLAG P2Y1- N-FLAG/ c-myc P2X1- N-FLAG P2X1- C-FLAG P2X1- N-FLAG/ c-myc P2Y1- HA-N P2Y1- HA-C P2Y1- VSV-N P2Y1- VSV-C Vektorschnittstellen Rezeptor N- terminaler Tag pCMV-Tag1 Bcl I / Bcl I Bgl II P2Y1 FLAG - C- terminaler Tag pCMV-Tag1 BamH I / BamH I BamH I P2Y1 - FLAG pCMV-Tag1 Bcl I / Sal I Bgl II / Sal I P2Y1 FLAG c-myc pCMV-Tag1 Bcl I / Bcl I Bgl II P2X1 FLAG - pCMV-Tag1 BamH I / BamH I BamH I P2X1 - FLAG pCMV-Tag1 Bcl I / Sal I Bgl II / Sal I P2X1 FLAG c-myc pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 HA - pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 - HA pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 VSV - pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 - VSV P2Y1-nat pcDNA3 BamH I / Xho I BamH I / Xho I P2Y1 - - Tab. 4 : Alle im Rahmen dieser Arbeit konstruierten Plasmide 4.8 TNT Quick Coupled Transcription / Translation System Expression der Konstrukte Als zusätzliche Absicherung zur Sequenzierung der klonierten Vektoren wurde der Ansatz der Invitro-Transkription und -Translation zur Anwendung gebracht: Mit Hilfe des TNT Quick Coupled Transcription / Translation System (PROMEGA) wurden ausgewählte Konstrukte auf ihre Fähigkeit hin, exprimiert zu werden, überprüft. 63
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Aus dem Institut für Klinische Bio
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4.3.5 Verlauf der ADP-induzierten C
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4.9 Expression in zellulären Syste
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1. Einleitung Thrombozyten sind mit
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1.1.2 Aktivierung durch lösliche A
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Thrombozyten dieser Tiere aggregier
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Phosphorylierung von VASP zumindest
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schnellen Kalzium-Einstrom, vermitt
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141. Shattil, S.J. 1999. Signaling
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Danksagung Die vorliegende Arbeit e
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