Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

4.5 Ergebnisse der Untersuchung der VASP Phosphorylierung in Thrombozyten
4.5.1 Festlegung der Konzentrationen für ADP, U-46619, PG-E1 und Epinephrin für die ex
vivo durchgeführten Messungen der VASP-Phosphorylierung in Thrombozyten
Da im Fall der VASP-Phosphorylierung parallel zur Bestimmung des cAMP-Spiegels der Einfluß der
Hemmung von ADP und Epinephrin auf die Phosphorylierung von VASP durch die Protein-Kinase
A gemessen werden sollte, wurde diese durch Zugabe von PG-E1, das den cAMP-Spiegel erhöht,
stimuliert. Die mimimalen Konzentrationen dieser Substanzen, mit denen ein maximaler und sicher
bei allen getesteten Probanden reproduzierbarer Effekt erreicht werden konnte, wurde in mehreren
Messungen vorher an eine Reihe von gesunden Probanden bestimmt: Für PG-E1 war diese
Konzentration 30 nM, für ADP 5 µM und für Epinephrin 55 µM.
4.5.2 ADP-induzierte Inhibition der mit PG-E1-stimulierten VASP-Phosphorylierung
4.5.2.1 Normales Verhalten der VASP-Phosphorylierung in ex vivo mit ADP und PG-E1
stimulierten Thrombozyten
Prinzipiell standen zur Bestimmung der VASP-Phosphorylierung zwei Antikörper zur Verfügung.
Der polyklonale Antikörper Anti-VASP-M4 erkennt VASP unabhängig von seinem
Phosphorylierungszustand. Eine Phosphorylierung am Serin 157 von VASP kann an einem
Molekuargewichts-shift im Polyacrylamidgel von 46kD (entspricht nicht phosphoryliert) nach 50kD
(entspricht phosphoryliert am Serin 157) erkannt werden. Für die Bestimmung der
Phosphorylierung am Serin 239, die keinen shift bewirkt, stand der monoklonale Anitkörper Anti-
Phospho-VASP-16C2 zur Verfügung. Dieser Antikörper ist spezifisch gegen die Phosphorylierung
am Serin 239 gerichtet und erkennt das unphosphorylierte Protein nicht.
Alle im weiteren aufgeführten Western-Blot-Abbildungen zeigen immer wieder den gleichen Aufbau
mit vier aufeinanderfolgenden Spuren: Spur 1 zeigt nicht-stimulierte Kontroll-Thrombozyten, Spur 2
mit 30 nM PG-E1-stimulierte Thrombozyten, Spur 3 mit 5 µM ADP versetzte Thrombozyten und
Spur 4 mit 30 nM PG-E1 und 5 µM ADP gleichzeitig versetzte Thrombozyten.
Dabei ergeben sich folgende Muster:
Abb. 15: Westernblot mit dem Erstantikörper Anti-VASP M4. Repräsentatives
Ergebnis eines typischen Stimulationsschemas mit 5 µM ADP und 30 nM PG-E1
an Thrombozyten eines gesunden Probanden.
1 2 3 4
Spur 1: Unstimulierte Thrombozyten. Spur 2: Stimulation mit 30 nM PG-E1. Spur
3: Stimulation mit 5 µM ADP. Spur 4: Gleichzeitige Stimuation mit 30 nM PG-E1 und 5 µM ADP.
52