Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Kombination von Permeabilisierung/Nicht-Permabilisierung und Einsatz der N- oder C-terminal
getaggten Rezeptoren sicher bestätigt werden. Zudem war durch “Durch”-Fokussieren eine
Zuordnung zur membranständigen Expression möglich. Die Konstrukte P2Y1-VSV-N, P2Y1-VSV-
C, P2Y1-HA-N sowie P2Y1-HA-C zeigten alle ein gleichartiges zelluläres Expressionsmuster.
4.9.3.2 Nachweis von P2X1
Auch alle Konstrukte für P2X1 wurden mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. Hierbei zeigten die
Flag-getaggten bzw. mit dem c-myc-Tag versehenen Rezeptoren ein dem P2Y1-Rezeptor
identisches Verteilungsmuster mit den gleichen kleinen punktförmigen Signalen, die homogen die
ganze Zelle überziehen.
Abb. 29: Subzelluläre Lokalisation der von dem Plasmid P2X1-C-Flag
exprimierten P2X1-Rezeptoren. Astrocytoma 1321 N1 – Zellen wurden mit
dem Plasmid transfeziert und mit dem anti-Flag M2 Antikörper inkubiert
und dann mit dem fluoreszenzmarkiertem Zweitantikörper Cy3 inkubiert
(Vergrößerung: 100x).
4.9.4 Analyse mittels Durchflusszytometrie
Für die COS-7- Zellen, die transient P2Y1-VSV-N exprimierten, wurde auch ein Verfahren zum
Nachweis der Expression der Rezeptoren mittels Durchflusszytometrie etabliert. Dies ist eine
ausgezeichnete Methode, um auch mit transient exprimierenden Zellen biochemische Analysen,
wie z.B. die Analyse der VASP-Phosphorylierung, durchzuführen, da die transient exprimierenden
und damit für das Experiment entscheidenden Zellen von den nicht-exprimierenden Zellen mittels
eines fluoreszenzgekoppelten Anti-Tag-Antikörpers separiert werden können und somit davon
getrennt analysiert werden können.
Nach der Auswertung der Ergebnisse zeigte sich folgendes:
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