Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Überstand abgenommen und zum entsprechenden Überstand des vorherigen Durchgangs
pipettiert. Danach werden die Proben bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet und in 500 µl 50 mM
Natriumacetatpuffer aufgenommen.
3.5.2 Bestimmung der cAMP-Konzentration durch Radioimmunoassay
Die Bestimmung von cAMP erfolgt durch den Radioimmunoassay Biotrak für cAMP [ 125 J] von
Amersham Pharmacia Biotech.
Proben und Standards (jeweils zweimal zur Doppelbestimmung; Standards im Bereich von 25-1600
fmol/100µl) werden mit radioaktivem 125 Jod-cAMP versetzt, nach Zugabe von Anti-Succinyl-cAMP-
Kaninchenserum gemischt und für 3 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wird
Anti-Kaninchen-IgG-Serums zugegeben, kurz gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wird der Antigen-Antikörper-Komplex durch Zentrifugation für 10 Minuten
bei 1500x g pelletiert, der Überstand durch Dekantieren der RIA-Röhrchen abgegossen und die im
Pellet vorhandene Radioaktivität in einem Gamma-Zähler bestimmt. Die im Pellet nachweisbare
Radioaktivität verhält sich umgekehrt proportional zu der in der Probe vorhandenen nichtradioaktiven
cAMP-Menge. Anhand der Eichkurve der Standardwerte und der Thrombozytenzahl in
der Probe wird die cAMP-Konzentration bestimmt.
3.6 Immunologischer Nachweis von Proteinen durch Western-Blot-Technik
3.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgt durch diskontinuierliche SDS-
Polyacryamid-Gele (81). Bei diesem Gelsystem werden die Proteine zunächst in einem Sammelgel
konzentriert und daran anschließend im Trenngel entsprechend ihrer molekularen Masse
aufgetrennt.
Als Sammelgel dient ein 3%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel mit folgender Zusammensetzung:
2 Sammelgele (3% Acrylamid)
30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 1 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,7 1,25 ml
10%-ige SDS-Lösung 100 µl
TEMED 5 µl
dH2O 7,25 ml
APS 10% 400 µl
24