Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

anderen Zellininen eine sehr einfache Handhabung sowie eine weite Verbreitung in vielen Labors.
Experimente, bei denen die Konstrukte transient exprimiert wurden, wurden häufig mit COS-7
Zellen durchgeführt, die 1321N1-Zellen für die Etablierung stabiler Zelllinien und den damit
verbundenen funktionellen Untersuchungen benutzt.
5.9.1 Transiente Expression
Verschiedene Methoden wurden mittels transienter Expression etabliert: Der Nachweis mittels
Western-Blot bzw. Immunpräzipitation, der Nachweis mittels Immunfluoreszenz und der Nachweis
im FACS.
In einem Standard-Western-Blot-Ansatz zum Nachweis der exprimierten Rezeptoren ließ sich
zunächst der P2X1-Rezeptor problemlos mit seinen beiden Tags nachweisen. Die Größe der
Bande entsprach dabei der vorher kalkulierten Größe, und da inzwischen auch ein kommerziell
erwerblicher Antikörper erhältlich ist sowie publizierte Daten anderer Guppen vorliegen (54;148),
die gleiche Ergebnisse zeigen, kann bei der detekierten Bande von der P2X1-Bande gesprochen
werden.
Anders dagegen die Situation im Falle des P2Y1: Mit dem Standard-Western-Blot-Ansatz aus
Zelllysat ließ sich der Rezeptor unabhängig von den verschiedenen Tags niemals nachweisen. Erst
nach Konzentration der Rezeptoren durch eine Immunpräzipitation konnte eine Bande im
anschließenden Western-Blot detekiert werden. Das erhaltene Signal allerdings zeigt deutliche
Unterschiede zu der einzelnen P2X1-Bande: Neben einer deutlichen Bande bei ca. 45 kDA, die der
vorherbestimmten Größe des Rezeptors im SDS-Gel entspricht, zeigt sich von ca. 60 kDA an
aufwärts ein breiter „Schmier“, der wohl die unterschiedlich glykosylierten Varianten des P2Y1
repräsentiert. In der Tat besitzt der P2Y1 3 Glykosylierungsstellen (74), und die Arbeiten an
anderen 7-Transmenbran-Rezeptoren mit Glykosilierungsstellen haben gezeigt, daß tatsächlich ein
ähnliches Signal auftritt (57). Bisher ist bemerkenswerterweise noch kein kommerziell erwerblicher
Antikörper gegen den P2Y1 verfügbar, und die wenigen publizierten Daten sind nicht einheitlich
(67;72). Dennoch kann in der Zusammenschau der eigenen Ergebnisse v.a. auch der
Immunfluoreszenz und des FACS davon ausgegangen werden, daß die Expression an der
Zelloberfläche stattfindet und die detekierten Banden auch tatsächlich den P2Y1 repräsentieren.
Eine mögliche Anwendung der Western-Blot-Methode könnte z.B. die Untersuchung einer
Expressionsveränderung der Rezeptoren unter verschiedenen Bedingungen sein, mit Hilfe des
Immunpräzipitation könnten weiterhin beispielsweise mögliche Bindungspartner verifiziert werden
(s.unten).
Auch mittels Immunfloureszenz konnten die beiden transient exprimierten Rezeptoren
nachgewiesen und analysiert werden. Die Immunfloureszenz-Aufnahmen von exprimierten P2X1-
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