Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Hier konnte nun in den 1321N1-Zellen keinerlei Beeinträchtigung der P2Y1-vermittelten Kalzium-
Freisetzung gemessen werden. Allerdings sollten auch diese Versuche noch mehrfach wiederholt
werden, eventuell auch mit unterschiedlichen Konzentrationen an 8-pCPT-cGMP.
Prinzipiell konnte aber gezeigt werden, daß mittels der Etabierung der Zelllinien und des Einsatzes
des Einzelzell-Kalzium-Meß-Systems eine relativ einfache Bearbeitung diese Fragestellungen
möglich ist.
Die gefundenen Unterschiede zwischen den Zelllinien und den Thrombozyten können
unterschiedliche Ursachen haben: Möglich wären z.B. unterschiedliche Signalwege in den
verschiedenen Zelltypen, und zwar „downstream“ der Kinasen. Dort könnten Unterschiede im
Expressionsprofil der beiden Zelltypen, wie z.B. einer exklusiven thrombozytären Expression eines
Effektorproteins bzw. fehlenden Expression eines einen Phosphorylierungsschritt hemmenden
Proteins, eine mögliche Ursache des Unterschieds sein.
Ein möglicher Ansatz zur Identifikation eines solch unterschiedlich exprimierten Proteins könnte die
Expression einer Thrombozyten-Bibliothek in den P2Y1-Zelllinien sein: Mittels des funktionellen
Ansatzes einer Messung der Inhibierung des Kalziumsignals könnte beispielsweise nach
Umstellung des Meßsytems auf eine automatisierte 96-well-Auslesung der Fluoreszenz ein
Screening nach diesem Protein durchgeführt werden.
Auch die Möglichkeit der direkten Inhibition der Kalzium-Freisetzung durch Phosphorylierung des
P2Y1-Rezeptors kann durch diese Experimente aber weiterhin nicht ausgeschlossen werden, da
die an diesem potentiell direkten Weg beteiligten Proteine zwar wahrscheinlich auch in den
Astrozytoma-Zellen vorhanden sind, mögliche Modifier- oder Ko-Faktoren allerdings unterschiedlich
exprimiert sein könnten. In der Tat besitzt der P2Y1 in seiner Aminosäure-Sequenz mehrere
potentielle Phosphorylierungsstellen sowohl für die A-Kinase als auch für die G-Kinase. Allerdings
konnte in ersten in-vitro-Phophorylierungs-Studien mit immunpräzipitierten P2Y1-Rezeptoren kein
Anhalt für eine mögliche Phosphorylierung sowohl durch die A-Kinase als auch durch die G-Kinase
gefunden werden (J.Brich und A. Smolenski, Daten nicht gezeigt). Hier jedoch können die jetzt
etablierten Zelllinien einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung dieser Frage beitragen, da die
Rezeptoren durch den Tag besser handzuhaben sind und mit den Zelllininen ein großes Resevoir
an Ausgangsmaterial vorhanden ist.
Ein weiterer möglicher Ansatz zur Eingrenzung der in Frage kommenden Proteine für eine
unterschiedliche Expression wäre die genaue Charakterisierung der durch den P2Y1 aktivierten
Signalwege. Interessant erscheinen hier z.B. die Map-Kinase-Signalwege (27), oder andere, durch
die βγ-Untereinheiten des an durch den P2Y1 aktivierten Gq-Proteins aktivierte Signalwege. Hier
könnte die an den Zelllinie etablierte Methode der FACS-Analyse einen wichtigen Beitrag liefern,
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