Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-HA-N bezeichnet.
4.7.2.2 pcDNA3-P2Y1-HA-C
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem C-terminalen HA-Tag. Für die
Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamH I und Xho I gewählt (s.o.).
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 154, der
eine BamH I-Schnittstelle und eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz enthält, und GIK 159, der
eine Xho I-Schnittstelle und die für das HA-Epitop kodierende Sequenz enthält, mittels PCR
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit
BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-HA-C bezeichnet.
4.7.3 VSV-tagging von P2Y1
Weiterhhin wurden im Fall des P2Y1 auch Konstrukte mit einem VSV-Tag entweder am Nterminalen
oder am C-terminalen Ende hergestellt. Die VSV-Sequenz stammt aus dem vesicular
stomatitis virus glycoprotein G und codiert für die Peptidsequenz YTDIEMNRLGK (73). Da auch für
diesen Tag kein die entsprechende Sequenz enthaltender Vektor vorhanden war, wurde er
ebenfalls mittels PCR angefügt und in den Expressionsvektor pcDNA3 kloniert.
4.7.3.1 pcDNA3-P2Y1-VSV-N
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem N-terminalen VSV-Tag. Für
die Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamHI und XhoI gewählt (s.o.).
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 156, der
eine BamH I-Schnittstelle, eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz sowie die für den VSV-Tag
kodierende Sequenz enhält, und GIK 155, der eine Xho I-Schnittstelle enthält, mittels PCR
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Xho I geschnitten und in den ebenfalls mit
BamH I und Xho I geschnittenen Vektor pcDNA3 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert
und ein korrekter Klon mit (pcDNA3-) P2Y1-VSV-N bezeichnet.
4.7.3.2 pcDNA3-P2Y1-VSV-C
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2Y1-Rezeptor mit einem C-terminalen VSV-Tag. Für
die Klonierung in das Plasmid pcDNA3 wurden die Schnittstellen BamH I und Xho I gewählt (s.o.).
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2Y1-cDNA mit den Primern GIK 154, der
eine BamH I-Schnittstelle und eine nach Kozak (80) optimierte Sequenz enthält, und GIK 157, der
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