Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

Hier konnte nun in den 1321N1-Zellen keinerlei Beeinträchtigung der P2Y1-vermittelten Kalzium- Freisetzung gemessen werden. Allerdings sollten auch diese Versuche noch mehrfach wiederholt werden, eventuell auch mit unterschiedlichen Konzentrationen an 8-pCPT-cGMP. Prinzipiell konnte aber gezeigt werden, daß mittels der Etabierung der Zelllinien und des Einsatzes des Einzelzell-Kalzium-Meß-Systems eine relativ einfache Bearbeitung diese Fragestellungen möglich ist. Die gefundenen Unterschiede zwischen den Zelllinien und den Thrombozyten können unterschiedliche Ursachen haben: Möglich wären z.B. unterschiedliche Signalwege in den verschiedenen Zelltypen, und zwar „downstream“ der Kinasen. Dort könnten Unterschiede im Expressionsprofil der beiden Zelltypen, wie z.B. einer exklusiven thrombozytären Expression eines Effektorproteins bzw. fehlenden Expression eines einen Phosphorylierungsschritt hemmenden Proteins, eine mögliche Ursache des Unterschieds sein. Ein möglicher Ansatz zur Identifikation eines solch unterschiedlich exprimierten Proteins könnte die Expression einer Thrombozyten-Bibliothek in den P2Y1-Zelllinien sein: Mittels des funktionellen Ansatzes einer Messung der Inhibierung des Kalziumsignals könnte beispielsweise nach Umstellung des Meßsytems auf eine automatisierte 96-well-Auslesung der Fluoreszenz ein Screening nach diesem Protein durchgeführt werden. Auch die Möglichkeit der direkten Inhibition der Kalzium-Freisetzung durch Phosphorylierung des P2Y1-Rezeptors kann durch diese Experimente aber weiterhin nicht ausgeschlossen werden, da die an diesem potentiell direkten Weg beteiligten Proteine zwar wahrscheinlich auch in den Astrozytoma-Zellen vorhanden sind, mögliche Modifier- oder Ko-Faktoren allerdings unterschiedlich exprimiert sein könnten. In der Tat besitzt der P2Y1 in seiner Aminosäure-Sequenz mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen sowohl für die A-Kinase als auch für die G-Kinase. Allerdings konnte in ersten in-vitro-Phophorylierungs-Studien mit immunpräzipitierten P2Y1-Rezeptoren kein Anhalt für eine mögliche Phosphorylierung sowohl durch die A-Kinase als auch durch die G-Kinase gefunden werden (J.Brich und A. Smolenski, Daten nicht gezeigt). Hier jedoch können die jetzt etablierten Zelllinien einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung dieser Frage beitragen, da die Rezeptoren durch den Tag besser handzuhaben sind und mit den Zelllininen ein großes Resevoir an Ausgangsmaterial vorhanden ist. Ein weiterer möglicher Ansatz zur Eingrenzung der in Frage kommenden Proteine für eine unterschiedliche Expression wäre die genaue Charakterisierung der durch den P2Y1 aktivierten Signalwege. Interessant erscheinen hier z.B. die Map-Kinase-Signalwege (27), oder andere, durch die βγ-Untereinheiten des an durch den P2Y1 aktivierten Gq-Proteins aktivierte Signalwege. Hier könnte die an den Zelllinie etablierte Methode der FACS-Analyse einen wichtigen Beitrag liefern, 98
die auch mit transient exprimierten Rezeptoren eine Analyse verschiedener Zell-Typen und unterschiedlicher Kinasesubstrate erlaubt. Ein weiterer Ansatz könnte die Suche nach möglichen intrazellulären Bindungspartnern des P2Y1 sein, z.B. mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Ansatzes. Zur Verifizierung möglicher Kandidaten könnten wiederum die Zelllinien einen entscheidenden Beitrag leisten, da die getaggten Rezeptoren einen Ko-Immunopräzipitationsansatz (sogennanter Pull-Down-Assay) ermöglichen könnten. Einen ersten Hinweis auf mögliche Bindungspartner konnten bereits Hall et al. 1998 liefern, als sie zeigen konnten, daß über eine C-terminale PDZ-Domäne ein Na/K + -Austauschfaktor an P2Y1 binden kann (60). Diese Ergebnisse könnten so Schritt für Schritt zu einer Aufklärung von Signalwegen führen. 99
Seite 1 und 2:
Aus dem Institut für Klinische Bio
Seite 3 und 4:
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1
Seite 5 und 6:
3.8 Methoden Molekularbiologie 28 3
Seite 7 und 8:
4.3.5 Verlauf der ADP-induzierten C
Seite 9 und 10:
4.9 Expression in zellulären Syste
Seite 11 und 12:
1. Einleitung Thrombozyten sind mit
Seite 13 und 14:
1.1.2 Aktivierung durch lösliche A
Seite 15 und 16:
Thrombozyten dieser Tiere aggregier
Seite 17 und 18:
Phosphorylierung von VASP zumindest
Seite 19 und 20:
schnellen Kalzium-Einstrom, vermitt
Seite 21 und 22:
vermitteln: Die bereits molekular i
Seite 23 und 24:
2.3 Vektoren und Plasmide Vektor Re
Seite 25 und 26:
2.5 Chemikalien und Lösungen Adren
Seite 27 und 28:
2.9 Antikörper und Antiseren Bezei
Seite 29 und 30:
PCR-Gerät (Gene Amp PCR System 240
Seite 31 und 32:
3.2 Thrombozytenpräparation aus Vo
Seite 33 und 34:
freien Kalziums im Zytosol gemessen
Seite 35 und 36:
Als Trenngel wird in allen Fällen
Seite 37 und 38:
inkubiert, anschließend fünfmal j
Seite 39 und 40:
3.8.3. Präparation größerer Meng
Seite 41 und 42:
cDNA-Ansatz wird nur bei erfolgreic
Seite 43 und 44:
mit Insert erscheinen weiß) verfü
Seite 45 und 46:
Zellen auf sterilisierten Deckgläs
Seite 47 und 48:
(Version 1.0, Becton Dickinson). In
Seite 49 und 50:
Anmerkung: Das HBS:Ca wurde erst am
Seite 51 und 52:
Zeitplan: CLOPIDOGREL 1 2 3 4 5 6 7
Seite 53 und 54:
dem für den jeweiligen Probanden s
Seite 55 und 56:
4.2.3 Synergistische Effekte von AD
Seite 57 und 58: 4.3.3 Normaler Verlauf einer ADP-in
Seite 59 und 60: Sowohl in der Ticlopidin-Studie als
Seite 61 und 62: fmol [cAMP] 30 20 10 0 Abb. 13: Rep
Seite 63 und 64: 1 2 3 4 Abb. 16: Westernblot mit de
Seite 65 und 66: 4.5.3.2 Verhalten der VASP-Phosphor
Seite 67 und 68: Funktion des getaggten Proteins bee
Seite 69 und 70: 4.7.1.4 pCMV-P2X1-N-Flag Beschreibu
Seite 71 und 72: BamH I und Xho I geschnittenen Vekt
Seite 73 und 74: 4.7.5 Zusammenfassung Plasmid Vekto
Seite 75 und 76: allerdings auf einem niedrigeren Ni
Seite 77 und 78: 97 67 57 45 40 27 1 2 3 4 5 6 Abb.
Seite 79 und 80: Kombination von Permeabilisierung/N
Seite 81 und 82: Mittels der nativen COS-7 Zellen wu
Seite 83 und 84: Dabei ergab sich folgendes Bild: 1
Seite 85 und 86: Mit ADP oder ATP lassen sich keine
Seite 87 und 88: 340 nm 10 s 60 s 100 s 160 s 190 s
Seite 89 und 90: Zusammenfassend ergab sich folgende
Seite 91 und 92: 4.10.5 Versuche zur Regulation des
Seite 93 und 94: gemessen werden, die in ihrer Grö
Seite 95 und 96: 5. Diskussion 5.1 Studiendesign Das
Seite 97 und 98: auch andere bei Patienten mit Ather
Seite 99 und 100: Blockade der Bindungsstelle für da
Seite 101 und 102: Aufgrund des zum ASS divergenten Wi
Seite 103 und 104: anderen Zellininen eine sehr einfac
Seite 105 und 106: 5.9.2 Stabile Expression Stabile Ze
Seite 107: Rezeptordichte (wie z.B. überexpri
Seite 111 und 112: 7. Abkürzungen und Maßeinheiten 1
Seite 113 und 114: SNP Sodium nitroprusside (Natrium N
Seite 115 und 116: 16. Caen, J.P., A.T. Nurden, C. Jea
Seite 117 und 118: 46. Garcia, A., A.B. Galler, U. Wal
Seite 119 und 120: 77. Klages, B., U. Brandt, M.I. Sim
Seite 121 und 122: 110. Paul, B.Z., J.L. Daniel, and S
Seite 123 und 124: 141. Shattil, S.J. 1999. Signaling
Seite 125 und 126: Danksagung Die vorliegende Arbeit e
Alle anzeigen

Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?