Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

(Version 1.0, Becton Dickinson). In Form von Histogrammen wird die Fluoreszenzintensität gegen
die Anzahl der Zellen aufgetragen.
3.9.8 Immunpräzipitation
Die auf 6 cm-Schalen ausgesäten, konfluenten Zellen werden zweimal kurz mit PBS gewaschen
und dann 20 Minuten auf Eis mit 0.5 ml 1x MIPP-Lösung, die zusätzlich verschiedene
Proteaseinhibitoren in Form einer Tablette Complete TM EDTA-frei (1 Tablette/10 ml) enthält,
versetzt, um die Zellen zu lysieren. Nach Abkratzen der Zellen werden diese dreimal durch eine
25G-Kanüle aufgezogen, um die Zellsuspension zu homogenisieren. Anschließend werden die
Zelllysate bei 4°C 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig abgenommen und mit
dem entsprechenden Antikörper versetzt. Nach 2-3 stündiger Inkubation bei 4°C unter ständigem
Drehen werden als Zweiantikörper ‘Dynabeads’, die an magnetische Beads gekoppelte
monoklonale Ratten-Antikörper gegen Maus-Antikörper der Subklasse IgG1 darstellen, zugegeben
und erneut 2-3 Stunden bei 4°C unter Drehen inkubiert. Dann wird das Präzipitat mit Hilfe eines
Magneten pelletiert, der Überstand abgenommen und das Pellet mit 20 µl 3x SDS bei
Raumtemperatur abgestoppt (20 Minuten). Die Proben werden dann bei –20°C gelagert.
Vor dem Auftragen in die Gel-Taschen werden die Proben fakultativ für einige Minuten auf 80°C
erhitzt. Pro Geltasche werden die kompletten 20 µl aufgetragen.
2 x MIPP-Lösung:
Tris 40mM pH 7,4
NaCl 150 mM
Natrium-Deoxycholat 2%
Triton X-100 2%
SDS 0,2%
Natrium-Pyrophosphat 20 mM
EDTA 20 mM
Natrium-Orthovanadat 1 mM
p-Nitrophenylphosphat 10 mM
Natrium-Fluorid 100 mM
3.9.9 Indirekte Immunfloureszenz
Auf Deckgläschen (Durchmesser 15 mm) bis zu max. 80% Konfluenz gewachsene Zellen werden
zweimal kurz mit PBS gewaschen und dann mit 4% (w/v) Formaldehyd in PBS (pH 7,4) 15 Minuten
auf Eis fixiert. Nach erneutem zweimaligen Waschen mit PBS werden die Zellen fakultativ 10
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