Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

mit Insert erscheinen weiß) verfügen und diese ohnehin nicht 100% zuverlässig ist, müssen die
Plasmide auf Insertion des Fragments überprüft werden. Dies erfolgt entweder über eine
analytische Spaltung der präparierten Plasmid-DNA (siehe 3.8.2.5.2) oder über eine PCR direkt aus
der Bakterien-Kultur für einen “Mini-Prep”.
Für die PCR wurde folgender Ansatz verwendet:
Übernacht-Kultur 1 µl
Primer I 1 µl
Primer II 1 µl
Q-Mix (QIAGEN)
ad 20 µl dH2O
10 µl
Das Programm kann auf 30 Zyklen (94°C 1 Minute, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute) beschränkt
werden.
Übernacht-Kulturen, die ein PCR-Produkt liefern, werden entsprechend 3.8.1.2 aufgearbeitet und
die Plasmid-DNA isoliert.
3.8.16 Plasmid-Sequenzierung
Zur genauerern Verifizierung der Klone werden diese sequenziert. Dabei wird folgende Reaktion
durchgeführt, beruhend auf der von Sanger et al 1977 beschriebenen Dideoxy-Methode (127):
Plasmid (= 5 µl bei 0.1 ug/µl für Doppelstrang-DNA) 500 ng
Sequenzier-Primer (T3, T7, SP6) (= 5 pmol aus 2.5 µm Stock-Lösung) 2 µl
Big Dye Terminator Ready Reaction Mix
ad 20 µl dH2O
8 µl
Programm:
96°C 10 Sekunden
50°C 5 Sekunden
60°C 4 Minuten
25 Zyklen, dann Abkühlung auf 4°C.
Anschließend wird die DNA mit 2 µl 3M Na-Acetat und 50 µl 100%igem Ethanol gefällt (30 Minuten
Zentrifugation bei 4°C) und mit 250 µl 80%igem Ethanol gewaschen (10 Minuten Zentrifugation bei
4°C). Nach vollständiger Entfernung des Ethanols wird das Pellet 2 Minuten in der Speedvac
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