Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

Mittels der nativen COS-7 Zellen wurde der Bereich der analysierten Signale („Gate”) festgelegt.
Die mit dem P2Y1-VSV-N Plasmid transfezierten COS-7 Zellen zeigten zwei unterschiedliche
Zellpopulationen: Die nicht transfezierten Zellen, die das niedrigere Fluoreszenz-Signal zeigen,
sowie die erfolgreich transfezierten Zellen, die den Rezeptor P2Y1-VSV-N exprimieren und somit
ein deutlich stärkeres Fluoreszenz-Signal liefern. Die zweite Population zeigt einen Anteil von ca.
50%, was der Transfektionsrate gleichgesetzt werden kann.
Die beiden zusätzlichen Kontrollen bestätigen dieses Ergebnis: In der Kontrolle mit einer
Tranfektion des Leer-Vektors pcDNA3, ansonsten aber identischer Probenbehandlung inklusive
Zugabe beider Antikörper konnte gezeigt werden, daß die Transfektionsprozedur keinen Einfluß auf
die Zellpopulation hat: Es erscheint nur das Signal der Population mit dem schwächeren
Fluoreszenzsignal. Dieses Signal ist auf einen durch die unspezifischen Bindungen des
fluoreszenz-gekoppelten Zeitantikörpers FITC-anti-mouse an die COS-7 Zellen zurückzuführen, wie
die zweite Kontrolle zeigt: Die mit dem P2Y1-VSV-N Plasmid transfezierten Zellen wurden ohne
Zugabe des anti-VSV-Antikörpers aber nach Zugabe des FITC-Antikörpers analysiert. Damit kann
der Umfang des Hintergrund-Signals analysiert werden.
4.9.5 Stabile Expression – Etablierung von Stabilen Zelllinien
Da mit den stabilen Zelllinien v.a. auch funktionelle Untersuchungen gemacht werden sollen, muß
die native Zelllinie ein wichtiges Kriterium erfüllen: Die Zellen dürfen nicht nur keine Expression von
P2Y1 und P2X1 zeigen, sondern dürfen zusätzlich auch kein Kalzium-Signal über andere purinerge
Rezeptoren aussenden, wenn sie mit ADP oder ATP stimuliert werden, da sonst eine klare
Zuordnung der Kalzium-Signale, die durch den P2Y1 oder P2X1 ausgelöst werden, nur sehr
schwer möglich wäre.
Nach umfangreicher Literatursuche und vielen eigenen Vorversuchen mit den Zelllinien COS-7,
HEK-239 und PTK-2, die alle nach Stimulation mit ATP oder ADP intrazellulär Kalzium freisetzen,
wurde schließlich eine humane Astrozytoma-Zellline mit dem Namen 1321N1 gewählt, für die
vorbeschrieben war, daß sie keinerlei purinerge Rezepetoren exprimiert (40). Dies konnte durch
eigene Versuche bestätigt werden: In den Einzelzell-Kalzium-Messungen konnte zu keinem
Zeitpunkt ein positives Signal nach ADP-Zugabe nachgewiesen werden. Als Positiv-Kontrolle für
ein regelmäßig auslösbares Kalzium-Signal konnte als Stimulanz Thrombin in einer Konzentration
von 0,5 U etabliert werden.
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