Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten
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inkubiert, anschließend fünfmal je 5-10 Minuten mit PBS-TT gewaschen und gebundene Aktivität<br />
durch Autoradiographie nachgewiesen.<br />
3.6.6.2 Nachweis durch Chemolumineszenz<br />
Bei allen an<strong>der</strong>en Antikörpern als den oben beschriebenen erfolgt <strong>der</strong> Nachweis des gebundenen<br />
Primärantikörpers durch eine Chemilumineszenz-Reaktion. Dabei wird die Lumineszenz, die bei <strong>der</strong><br />
Peroxidase-katalysierten Oxidation eines zyklischen Diacylhydrazids (Luminol) durch H2O2 entsteht,<br />
zum Nachweis des an Meerettich-Peroxidase gekoppelten Sekundärantikörpers genutzt. Nach<br />
einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur mit dem in Blockmedium verdünnten<br />
Sekundärantikörper (1:1500 für Anti-Kaninchen-AK, 1:2500 für Anti-Maus-AK) und fünfmaligem<br />
Waschen in PBS-TT für je 5-10 Minuten wird die Nitrocellulose für 1 Minute mit Detektionsmix<br />
inkubiert, nach Abtropfen <strong>der</strong> Lösung in Overhead-Folie verpackt und sofort für einige Sekunden bis<br />
zu wenigen Minuten <strong>auf</strong> einem Film exponiert.<br />
3.6.7 Quantitative Auswertung <strong>der</strong> radioaktiven Immunomarkierung<br />
Die radioaktiv markierten Proteinbanden werden mit einem Skalpell ausgeschnitten und die<br />
gebundene Aktivität als radioaktive Zerfälle pro Minute (counts per minute (cpm)) in einem Gamma-<br />
Zähler bestimmt. Da die gebundene Radioaktivität proportional zur Menge des <strong>auf</strong> <strong>der</strong><br />
Nitrocellulose vorhandenen und spezifisch markierten Proteins ist, erlaubt die Bestimmung <strong>der</strong> cpm<br />
eine quantitative Auswertung <strong>der</strong> vorhandenen Proteinmenge.<br />
3.7 Proben<strong>auf</strong>bereitung <strong>der</strong> Proteine für den Nachweis mittels Western-Blot-Technik<br />
3.7.1 Westen-Blot-Proben-Aufbereitung für den Nachweis von VASP-Proteinen aus<br />
<strong>Thrombozyten</strong><br />
Nach Stimulation werden 300 µl PRP für 10 Sekunden bei 14000 rpm zentrifugiert, <strong>der</strong> Überstand<br />
abgesaugt und das Pellet in 100 µl heißer 1x SDS-Lösung <strong>auf</strong>genommen. Anschließend werden<br />
die Proben für 10 Minuten bei 95°C gekocht. Gegebenenfalls werden die Proben danach bei –20°C<br />
eingefroren.<br />
Vor dem Auftragen <strong>auf</strong> das Acrylamidgel werden die Proben mit 3 µl ß-Mercaptoethanol versetzt<br />
und für 5 Minuten bei 80°C erhitzt. Pro Geltasche werden zwischen 15 und 20 µg Gesamtprotein<br />
<strong>auf</strong>getragen.<br />
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