Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

3.8.7 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem QIAquick PCR Purification Kit
Nach PCR-Amplifikation erfolgt die Abtrennung des PCR-Produktes von den im Ansatz enthaltenen
dNTPs, Primern und der Polymerase mit dem QIAquick PCR Purification Kit nach
Standardprotokoll. Die Säule wird mit 30 µl dH2O eluiert. Um die Ausbeute zu erhöhen, wird die
Säule mit dem Wasser zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und/oder das Eluat erneut
geladen.
3.8.8 RNA-Isolierung aus humanen Thrombozyten mit TRIZOL
Mehrfach gewaschene und konzentrierte Thrombozytenpellets (ca. 50 µl), die aus
Thrombozytenkonzentraten der Transfusionsmedizinischen Abteilung der Universitätsklinik
Würzburg gewonnen wurden, werden mit 650 µl TRIZOL-Reagenz resuspendiert und mit Hilfe des
QIAshredders (QIAGEN) durch zweiminütige Zentrifugation homogenisiert. Nach Zugabe von
weiteren 800 µl der TRIZOL-Reagenz und 300 µl Chloroform wird das Gemisch mittels eines Vortex
so lange geschüttelt, bis eine einheitliche rosa Farbe zu sehen ist. Nach der anschließenden 15minütigen
Zentrifugation bei 4°C wird die oberste der drei entstandenen Phasen, welche die RNA
enthält, vorsichtig abgenommen und mit 700 µl Isopropanol präzipitiert (Zentrifugation für 15
Minuten bei 4°C). Nach Abnehmen des Überstandes wird das RNA-Pellet mit 80%igem Ethanol
gewaschen (Zentrifugation für 5 Minuten bei Raumtemperatur). Nach Entfernung des Alkohols wird
das Pellet 2-3 Minuten in der Speedvac angetrocknet und dann mit 20 µl eines Rnase-freien
Wassers aufgelöst (1-1,5 h bei 4°C). Anschließend wird die Konzentration der RNA mit Hilfe der
Bestimmung der OD (siehe 3.8.1.4) berechnet und die Qualität der RNA mit einer qualitativen
Agarosegel-Elektrophorese beurteilt. Die restliche RNA wird bei –80°C gelagert.
3.8.9 RNA-Isolierung aus Astrocytoma 1321 N1 Zellen mit TRIZOL
Für den Nachweis von P2Y1-mRNA aus Astrozytoma Zellen wird Gesamt-RNA aus den Zellen
eines Wells einer 6-Well-Platte nach Standardprotokoll gewonnen und mittels einer qualitativen
Gelelektrophorese beurteilt. Nach der OD-Bestimmung wird die RNA dann bei – 80°C gelagert.
3.8.10 Reverse Transkription – cDNA-Herstellung mit Hilfe des ProSTAR First-Strand RT-PCR
Kit
Die cDNA-Herstellung erfolgt nach Standardprotokoll. Es werden oligo(dT)-Primer und Random-
Hexamer Primer verwendet. Nach Beendigung der Reaktion wird die Qualität der cDNA mit Hilfe
des Gene Checker Kit überprüft, das Primer-Sets für die Amplifikation verschiedener Fragmente
von 5 hoch konservierten und ubiquitär exprimierten Genen enthält: GAPDH (ergibt 540 bp-
Fragment), 5’ Aktin (1 kb), 3’ Aktin (720 bp), 6K Clathrin (570 bp) und 2K Clathrin (550 bp). Jeder
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