Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

cDNA-Ansatz wird nur bei erfolgreicher Amplifikation von mindestens zwei verschiedenen
Fragmenten weiterverwendet.
3.8.11 Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die genauen Reaktionsbedingungen der einzelnen Polymerasen können den
Gebrauchsanweisungen entnommen werden. Die 10x-Amplifikationspuffer werden vom jeweiligen
Hersteller mitgeliefert.
Der Reaktionsansatz enthält:
10x-Amplifikationspuffer der entsprechenden Polymerase 10 µl
dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Stammlösung: 2.5 mM) 200-250 µM
Oligonukleotid I 1 µM
Oligonukleotid II 1 µM
DNA-Template 50-100 ng
Taq-Polymerase oder Pfu-Polymerase
ad 100 µl dH2O
3,5 U
Im Thermocycler werden 20-30 Zyklen mit folgendem Standardprogramm durchlaufen:
Denaturierung: 94°C 1 Minute
Primer-Annealing: 50-60°C 1 Minute
Extension: 72°C 1-2 Minuten
Vor jeder Reaktion wird ein initialer Denaturierungsschritt von 3-5 Minuten bei 95°C und nach jeder
Reaktion ein finaler Syntheseschritt von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt.
Zur Ergebniskontrolle werden jeweils 10 µl des PCR-Ansatzes in einem Agarosegel analysiert.
Als DNA-Template werden entweder cDNA, PCR-Produkte oder Plasmid-DNA verwendet.
3.8.12 Verdau von PCR-Fragmenten oder Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen
10x - Enzympuffer und gegebenenfalls BSA werden vom Hersteller mitgeliefert.
3.8.12.1 Präparative Spaltungen
Für präparative Spaltungen von PCR-Produkten oder Plasmid-DNA wird ein Gesamtvolumen von
50 µl gewählt. Für den Verdau von ca. 4 µg DNA werden 20 U des jeweiligen Enzyms bei der
jeweils optimalen Temperatur (37°C, 50°C, 65°C) für zwei Stunden eingesetzt.
Um eine Religation der geschnittenen Plasmide zu verhindern, werden die Plasmide direkt im
Anschluß mit 1 µl Calf Intestinal Phosphatase (CIP) für eine Sunde bei 37°C versetzt. Dieser Schritt
31