Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

4.7.1.4 pCMV-P2X1-N-Flag
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2X1-Rezeptor mit einem N-terminalen FLAG-Tag.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2X1-cDNA mit den Primern GIK 142 und
GIK 143, die jeweils eine Bcl I-Schnittstelle enthalten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Bcl
I geschnitten und in den mit Bgl II geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert. Verschiedenen Klone
wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pCMV-) P2X1-N-Flag bezeichnet.
4.7.1.5 pCMV-P2X1-C-Flag
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2X1-Rezeptor mit einem C-terminalen FLAG-Tag.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2X1-cDNA mit den Primern GIK 144 und
GIK 148, die jeweils eine BamH I-Schnittstelle enthalten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit
BamH I geschnitten und in den ebenfalls mit BamH I geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert.
Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein korrekter Klon mit (pCMV-) P2X1-C-Flag
bezeichnet.
4.7.1.6 pCMV-P2X1-N-Flag/C-c-myc
Beschreibung: Das Plasmid exprimiert den P2X1-Rezeptor mit einem N-terminalen FLAG-Tag und
einem C-terminalen c-myc-Tag.
Konstruktion: Zur Herstellung des Plasmids wurde die P2X1-cDNA mit den Primern GIK 142, der
eine Bcl I-Schnittstelle enthält (vgl. oben) und GIK 145, der eine Sal I-Schnittstelle enthält,
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Bcl I und Sal I geschnitten und in den mit Bgl II und Sal I
geschnittenen Vektor pCMV-Tag1 ligiert. Verschiedenen Klone wurden sequenziert und ein
korrekter Klon mit (pCMV-) P2X1-N-Flag/C-c-myc bezeichnet.
4.7.2 HA-tagging von P2Y1
Zusätzlich wurden im Falle des P2Y1 Konstrukte mit einem HA-Tag entweder am N-terminalen
oder am C-terminalen Ende hergestellt. Die HA-Sequenz kodiert das human influenza
hemagglutinin-Protein mit der Peptid-Sequenz YPYDVPEDPED (73). Da für diesen Tag kein die
entsprechende Sequenz enthaltender Vektor vorhanden war, wurde er mittels PCR angefügt und in
den Expressionsvektor pcDNA3 kloniert.
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