Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten

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5. Disskusion 85 5.1 Studiendesign 85 5.2 Aggregation als Parameter der Wirksamkeit 86 5.3 Beeinflussung des P2X1 87 5.4 Beeinflussung des P2Y1 88 5.5 Beeinflussung des P2Yac/12 88 5.6 Beeinflussung des Phosphorylierungsstatus von VASP 89 5.7 Zusammenfassung/Ausblick 89 5.8 Klonierung der Rezeptoren / Plasmidkonstruktion 92 5.9 Expression in Zellen 92 5.9.1Transiente Expression 93 5.9.2 Stabile Expression 95 5.10 Calcium-Einzel-Zell-Messungen 95 5.10.1 P2X1 95 5.10.2 P2Y1 96 5.10.3 Erste Versuche zur Regulation der Rezeptoren 97 6. Zusammenfassung 100 7. Abkürzungen und Maßeinheiten 101 8. Literatur 104 Danksagung Lebenslauf
1. Einleitung Thrombozyten sind mit 2-4 µm Durchmesser die kleinsten Zellen im Blutkreislauf. Der Normbereich der Thrombozytenkonzentration im Blut des Menschen beträgt 150.000 – 300.000 Zellen pro µl. Entstehungsort der Thrombozyten ist das Knochenmark, wo sie durch Abschnürungen des Zytoplasmas der Megakaryozyten entstehen. Nach einer Lebenszeit von 7 bis 10 Tagen erfolgt der Abbau in der Leber und in der Milz. Die besonderen Kennzeichen der Thrombozyten sind die diskoide Form („Plättchen“) und das Fehlen eines Zellkerns. Die Aufgabe der Thrombozyten liegt vorwiegend in der primären Blutstillung (Hämostase), die durch eine Vernetzung von Thrombozyten, der sogenannten Thrombozytenaggregation, gekennzeichnet ist (47). Im intakten Gefäßsystem zirkulieren die Thrombozyten frei im Blut. Bei einer Verletzung der Gefäßinnenwand kommt es zu einer Freilegung von prothrombotischem Gewebe sowie zur Freisetzung löslicher Plättchenagonisten, was zu einer Aktivierung und Adhäsion von Thrombozyten an der Stelle der Verletzung führt. Die Folgen sind eine Formveränderung der Zellen („shape change“), die Sekretion von Plättchenaktivatoren aus den Granula und das Vernetzen von Thrombozyten miteinander, die sogennante Aggregation. Dieser Prozeß wird als primäre Hämostase bezeichnet, makroskopisch entsteht ein weißer Thrombus. Parallel dazu kommt es zu einer Aktivierung der Gerinnungskaskade. Dadurch werden Fibrinfibrillen gebildet, die sich an den Thrombus anlagern und diesen stabilisieren. Das Ergebnis dieser sogenannten sekundären Hämostase ist ein durch Miteinlagerung von Erythrozyten entstandener roter Thrombus (47). Durch die klassischen Risikofaktoren Bluthochdruck, Diabetes, Hypercholesterinämie sowie Tabakkonsum kann es zur Ausbildung von Artherosklerose kommen. Die dadurch hervorgerufenen Veränderungen der Gefäßinnenwand bringen die normalerweise streng regulierte Balance von aktivierenden und hemmenden Einflüssen auf die im Blutfluß zirkulierenden Thrombozyten außer Kontrolle: Aktivierende Einflüsse gewinnen die Oberhand, eine unkontrollierte Thrombozytenaggregation kann die Folge sein. Ähnlich dem physiologischen Vorgang der Aggregationseinleitung durch eine Freilegung von prothrombotischen Gewebe nach einer akuten Verletzung können Thrombozyten auch auf rupturierten atherosklerotischen Plaques und in Regionen veränderten Blutflusses aktiviert werden, was zur Exazerbation der bestehenden Läsionen führt: Die Folge können Herzinfarkt, peripherer Gefäßverschluß oder Schlaganfall sein (43). Diese Erkrankungen des Gefäßsystems stellen die häufigste Todesursache in den industrialisierten Ländern der westlichen Welt dar. Die Aktivierung von Thrombozyten muß daher ein exakt regulierter Vorgang sein: Unter physiologischen Bedingungen ist er lebenswichtig zur Verhinderung eines größeren Blutverlustes, unter pathophysiologischen Umständen kann er aber zur akuten Lebensbedrohung werden. Ziel 1
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Seite 13 und 14: 1.1.2 Aktivierung durch lösliche A
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Seite 21 und 22: vermitteln: Die bereits molekular i
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fmol [cAMP] 30 20 10 0 Abb. 13: Rep
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1 2 3 4 Abb. 16: Westernblot mit de
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4.5.3.2 Verhalten der VASP-Phosphor
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Funktion des getaggten Proteins bee
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4.7.1.4 pCMV-P2X1-N-Flag Beschreibu
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BamH I und Xho I geschnittenen Vekt
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4.7.5 Zusammenfassung Plasmid Vekto
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allerdings auf einem niedrigeren Ni
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97 67 57 45 40 27 1 2 3 4 5 6 Abb.
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Kombination von Permeabilisierung/N
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Mittels der nativen COS-7 Zellen wu
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Dabei ergab sich folgendes Bild: 1
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Mit ADP oder ATP lassen sich keine
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340 nm 10 s 60 s 100 s 160 s 190 s
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Zusammenfassend ergab sich folgende
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4.10.5 Versuche zur Regulation des
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gemessen werden, die in ihrer Grö
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5. Diskussion 5.1 Studiendesign Das
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auch andere bei Patienten mit Ather
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Blockade der Bindungsstelle für da
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Aufgrund des zum ASS divergenten Wi
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anderen Zellininen eine sehr einfac
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5.9.2 Stabile Expression Stabile Ze
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Rezeptordichte (wie z.B. überexpri
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die auch mit transient exprimierten
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7. Abkürzungen und Maßeinheiten 1
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SNP Sodium nitroprusside (Natrium N
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16. Caen, J.P., A.T. Nurden, C. Jea
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46. Garcia, A., A.B. Galler, U. Wal
Seite 119 und 120:
77. Klages, B., U. Brandt, M.I. Sim
Seite 121 und 122:
110. Paul, B.Z., J.L. Daniel, and S
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141. Shattil, S.J. 1999. Signaling
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Danksagung Die vorliegende Arbeit e
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